[发明专利]一种基于LC-MS高通量高灵敏度检测植物激素的方法

权利要求书

1.一种基于LC-MS高通量高灵敏度检测植物激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1：配制同位素内标品植物激素混合溶液，分别称取各种同位素内标品植物激素，包括：D-tZ、D-tZR、D-iPR、D-iP、D-BL、D-ABA、D-SA、D-ACC、D-DHZ、D-GA1、D-GA4和D-CS，分别加入甲醇溶液溶解制成质量浓度相同的12种同位素内标品植物激素母液，取相同体积的各种同位素内标品植物激素母液混合均匀，并用50％的甲醇水溶液稀释，制成200ng/mL的同位素内标品植物激素混合溶液，备用；

步骤S2：配制标准品植物激素溶液，分别称取标准品植物激素，再分别加入甲醇溶液溶解制成质量浓度相同的标准品植物激素母液，取相同体积的各种标准品植物激素母液混合均匀，并用50％的甲醇水溶液稀释，制成1000ng/mL的标准品植物激素溶液，备用；所述的标准品植物激素溶液包括：吲哚乙酸IAA、反式玉米素tZ、顺式玉米素cZ、反式玉米素核苷tZR、顺式玉米素核苷cZR、异戊烯腺嘌呤核苷iPR、异戊烯基腺嘌呤iP、赤霉素GA3、茉莉酸JA、油菜素内酯BL、脱落酸ABA、水杨酸SA、1-氨基环丙烷羧酸ACC、二氢玉米素DHZ、赤霉素1GA1、赤霉素7GA7、赤霉素4GA4、茉莉酸异亮氨酸JA-Ile、12-氧-植物二烯酸cis-OPDA、油菜素甾酮CS和香蒲甾醇TY；

步骤S3：构建标准曲线，用50％甲醇水溶液将步骤S2制得的标准品植物激素溶液分梯度稀释至1ng/mL，每梯度浓度的标准品植物激素溶液取50μL并分别加入10μL步骤S1制得的同位素内标品植物激素混合溶液，混合均匀，再分别加入940μL甲醇/乙腈/水混合液，混合均匀，静置12-24小时，再离心取上清液置于Ostro 25mg 96孔板中过滤，滤液用氮气吹干，再用200μL的50％乙腈溶液复溶，离心，取上清液进行液相色谱-串联质谱分析，得到标准曲线；

步骤S4：样品分析，取植物组织样本，加入10μL步骤S1制得的同位素内标品植物激素混合溶液，混合均匀，再加入990μL甲醇/乙腈/水混合液，混合均匀，静置12-24小时，再离心取上清液置于Ostro 25mg 96孔板中过滤，滤液用氮气吹干，再用200μL的50％乙腈溶液复溶，离心，取上清液进行液相色谱-串联质谱分析，将分析结果使用构建的标准曲线换算出对应的植物激素浓度；

步骤S3和S4中的液相色谱的洗脱方式是流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：0.05％甲酸的乙腈溶液；色谱柱型号：BEH C18 1.7μm,2.1mm×100mm；流速为400μL/min，柱温为50℃，进样量为4μL，流动相A和B的配比如下表：

时间(min)	％A	％B
0	98	2
0.5	98	2
1	90	10
5	80	20
10	30	70
10.2	5	95
11	5	95
11.1	98	2
13	98	2

洗脱时间为13min；

步骤S3和S4中的质谱分析条件如下：

采用电喷雾电离正负离子同时扫描检测模式和多反应监测的质谱扫描模式；

正离子扫描模式条件如下：离子源温度：550℃，雾化气压：55，辅助气压：50，气帘气：30，喷雾电压：4500V；正离子模式对应的植物激素包括：反式玉米素tZ、顺式玉米素cZ、二氢玉米素DHZ、反式玉米素核苷tZR、异戊烯腺嘌呤核苷iPR、异戊烯基腺嘌呤iP、油菜素内酯BL、油菜素甾酮CS、香蒲甾醇TY、1-氨基环丙烷羧酸ACC、吲哚乙酸IAA和顺式玉米素核苷cZR；

负离子扫描模式条件如下：离子源温度550℃，雾化气压：55，辅助气压：50，气帘气压：30，喷雾电压：-4500V；负离子模式对应的植物激素包括：赤霉素GA3、茉莉酸JA、脱落酸ABA、水杨酸SA、赤霉素1GA1、赤霉素7GA7、赤霉素4GA4、茉莉酸异亮氨酸JA-Ile和12-氧-植物二烯酸cis-OPDA。