[发明专利]一种用于表达RP11-395G23.3的序列及其构建体和构建方法与应用

权利要求书

1.一种用于表达RP11-395G23.3的序列，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种构建体，其特征在于，该构建体包括质粒载体EcoRI和BamHI限制性上下游酶切位点之间的如SEQID NO.1所示DNA序列，构建体序列为SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的构建体，其特征在于：RP11-395G23.3的过表达质粒为：

pLenti-EF1a-EGFP-F2A-Puro-CMV-LncRNA(RP11-395G23.3)。

4.根据权利要求3所述的构建体，其特征在于：质粒载体为H145。

5.一种权利要求2所述构建体的构建方法，包括：

A、目的基因片段的获得，通过PCR进行扩增方式或通过酶切方式得到目的基因；

其中通过PCR进行扩增得到目的基因的方式中，使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因，反应体系和条件如下：

按下列组分配制PCR反应液：

PCR反应条件设置如下：

①3 Step法

②2 Step法

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收；

通过酶切得到目的基因的方式中：

用限制性内切酶对含有目的基因的质粒进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0做胶回收；

B、线性化表达载体的制备，用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μL，限制性内切酶各1μL，用水补足50μL，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收；

C、目的基因构建入线性化表达载体中，使用无缝克隆试剂盒、无缝组装试剂盒和使用T4 DNA连接酶中任意一种方式将目的基因构建入线性化表达载体；

其中使用无缝克隆试剂盒的方式中，将目的基因片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应，各组分为：

总体积为20μL

最适插入片段使用量＝[0.04x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)，

最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)，

混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化；

使用无缝组装试剂盒的方式中，将目的基因片段和线性化载体以摩尔比1:1加到离心管中进行重组反应，分组分为：

总体积为20μL

最适插入片段使用量＝[0.02x插入片段碱基数]ng(0.03pmol)，

最适线性化载体使用量＝[0.02x线性化载体碱基数]ng(0.03pmol)，

混匀后在37℃孵育30分种，然后转移到冰上放置5分钟。直接转化或者置于-20℃保存等需要转化时解冻转化；

使用T4DNA连接酶的方式中：

将目的基因片段和线性化载体以摩尔比3∶1加到离心管中进行连接反应。线性化的表达载体一般加入100ng，目的基因片段加入量为300x目的基因碱基对数/线性化的表达载体碱基对数(单位ng)，各组分为；

混匀后在16℃连接过夜，取10μL反应液体转化到感受态细胞中；

D、DH5α感受态细胞的制备和转化；

E、菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl作为模板进行菌落PCR鉴定，反应体系和PCR循环条件如下：

PCR反应液组成为：

PCR反应条件为：

3 Step PCR

2 Step PCR

F、阳性克隆送测序。

6.一种权利要求2所述构建体在抑制子宫内膜癌中的应用。