[发明专利]一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法

权利要求书

1.一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，其包括以下步骤：

步骤1、选取最优互补区及最优互补短链探针：

将已获得的长链核酸适配体作为候选核酸适配体，根据全长序列碱基数，规划出n个区，每个区包含20个碱基，每个区设计7-20个碱基的互补短链探针；在室温下将待表征的长链核酸适配体与浓度为0-1000nM的靶标分子在结合溶液中反应5-30分钟后，加入含有SYBRGreen I的各互补短链探针进行反应，实验结果通过四参数方程进行拟合，四参数方程为：

其中，I_F为荧光响应值；C_OTA为靶标分子浓度；A_max表示四参数方程拟合后获得的最大值；A_min表示四参数方程拟合后获得的最小值；IC₅₀表示四参数方程拟合后获得的半抑制值；式中的p为C_OTA为IC₅₀时拟合曲线的斜率；

通过工作曲线的解析获得各互补短链探针(A_max-A_min)/IC₅₀值，选取(A_max-A_min)/IC₅₀值最大互补短链探针，为最优互补短链探针；

步骤2、初步获得较优核酸适配体：

步骤1)中确定的最优互补短链探针所对应区为核酸适配体的核心识别区，从原核酸适配的两端向核心区每次减少3个碱基，设计一系列新的核酸适配体，通过步骤1)的方法获得新核酸适配体的IC₅₀值，选出IC₅₀值最小的为较优核酸适配体。

步骤3、获得最短核酸适配体序列：

将步骤2)获得的较优核酸适配体从核酸适配两端向核心区每次减少一个碱基，设计一系列一碱基截短核酸适配体，采用步骤1)的方法，将步骤1)中确定的最优互补短链探针、靶标分子和各一碱基截短核酸适配体进行反应，获得各一碱基截短核酸适配体所对应的IC₅₀值，选出IC₅₀值最小的或IC₅₀值较小但结构为尾端互补的为核酸适配体核心序列，即最短核酸适配体序列。

步骤4、构造亲和性更高的核酸适配体：

将步骤3)获得的最短核酸适配体序列，通过结构解析，增加结构稳定性的方法，获得亲和性更高的核酸适配体，即解析序列。

2.根据权利要求1所述的一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤1)所述的候选核酸适配体为一种序列或多种序列，包括60-100个碱基。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤1)所述的互补短链探针长度为7-20个碱基。

4.根据权利要求1或2所述的一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤4)中所述的解析序列的长度为14-45个碱基。

5.根据权利要求3所述的一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤4)中所述的解析序列的长度为14-45个碱基。

6.根据权利要求1、2或5所述的一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其特征在于，步骤1)所述的结合溶液中NaCl的浓度为80-200nM；钙离子或者镁离子的浓度为1-30mM；Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10-30mM，pH为5-10；表面活性剂为Tween20，其质量分数为0.01％-0.2％。