[发明专利]一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法

说明书

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其包括包括提出亲和性评价标准，互补短链探针位置的选择，互补短链探针碱基数的优化，以及核酸适配体最优序列的优化等步骤。本发明提供的基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法可用于任何类型靶标的核酸适配体优化。本发明针对不同靶标或不同核酸适配体，表征方法简单且成本低廉、通量高。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。

背景技术

核酸适配体(Aptamer，也译为核酸识体、核酸适体、适配体)是指通过指数富集配体系统进化法(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从人工合成的DNA或RNA文库中筛选出来的、能够对靶标高亲合性地结合和高特异性识别的单链寡核苷酸。随机文库的基本序列结构包括：中间随机序列长度为35-60个碱基，两端用于扩增的引物长度分别约为 20个碱基。最终筛选到的核酸适配体的总长度约60-100个碱基。

核酸适配体可以形成独特的三维结构，这使得核酸适配体可以更好地和靶标相结合，核酸适配体的靶标小到离子、单分子，大到整个细胞。核酸适配体对于靶标具有很好的选择性和很强的亲和力，这使其具有超过传统识别元素的优势，在某种程度上可以与抗体相媲美。因此核酸适配体替代传统抗体在多种疾病的基础研究、药物筛选、临床诊断及疾病治疗中具有广泛的应用前景。

在已报道研究中发现核酸适配体长度过长不利于形成稳定的结构，且易引起不必要的碱基错配，从而影响识别过程。通过去除与识别区域不相关对的非必要序列，仅保留识别的核心区域，可以使核酸适配体长度大大缩短；再通过解析可能的空间结构，增加提升结构稳定性的结构域，从而实现提高核酸适配体与靶标结合的亲和力和特异性。通过优化获得的高亲和性核酸适配体可以充分利用碱基，降低合成成本。当前，已被广泛应用的核酸适配体，例如凝血酶适配体、ATP适配体、IgE适配体等，其核心序列长度在15-30个碱基。现有大量已筛选出的核酸适配体由于序列过长无法获得充分利用，因此对于筛选到的核酸适配体进行序列优化，已成为其得到进一步应用的必经之路，而且是亟待解决的难题。

对核酸适配体进行序列优化的方法包括生物信息学预测法、酶切保护实验、芯片分析法等。生物信息学预测法是基于热力学最小自由能等算法预测核酸适配体的二级结构，但由于各算法可预测到的核酸二级结构十分有限，其可靠性难以保证；酶切保护实验是利用核酶水解核酸适配体与靶标结合的复合物，这样可以得知核酸适配体与靶标结合的部分序列，但该方法无法得知核酸适配体中对稳定性起关键作用的非结合序列；芯片技术是将核酸适配体的截短片段制成芯片，利用荧光修饰靶标与芯片的结合信号，优选亲和力更好的优化序列，该方法准确性高，但成本过于昂贵。由于目前对于核酸适配体进行序列优化尚缺乏快速、准确、令人满意的方法，特别是通量和成本这两大难点。

专利CN108387561A公开了一种基于碱基淬灭荧光原理实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其利用G碱基具有淬灭荧光素的特性，使用荧光素标记的短链核酸来高通量筛选、优化无修饰的核酸适配体。专利 CN108387561A所用的荧光素标记的短链核酸合成成本较高，虽然与双荧光标记的方法相比优化成本降低了一半，但是成本仍然较高，例如，互补短链探针的设计难度及合成成本相对较高，不适于高通量优化。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中操作复杂、通量较低、成本较高等问题，提供一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于免标记杂交探针竞争法实现低成本高通量核酸适配体最优序列的优化方法，其包括以下步骤：

步骤1、选取最优互补区及最优互补短链探针：