[发明专利]分离纯化胎儿有核红细胞的试剂盒有效

专利信息
申请号: 202010186566.3 申请日: 2016-07-11
公开(公告)号: CN111500534B 公开(公告)日: 2022-11-29
发明(设计)人: 夏庆杰;杨林;杨雪飞 申请(专利权)人: 山东亚大药业有限公司
主分类号: C12N5/078 分类号: C12N5/078
代理公司: 北京天昊联合知识产权代理有限公司 11112 代理人: 高钊;王静
地址: 252000 *** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 分离 纯化 胎儿 红细胞 试剂盒
【说明书】:

发明涉及一种从孕妇外周静脉血样中分离纯化胎儿有核红细胞的试剂盒,其中包括:红细胞裂解液,用于对孕妇外周静脉血样中的无核红细胞进行裂解处理;细胞固定化试剂,用于对裂解后获得的有核细胞进行固定化处理;CD45抗体标记磁珠,用于对血样中细胞进行负筛选,以将非有核红细胞除去;CD71抗体标记磁珠,用于进行初次正筛选;抗体洗脱液,用于将初次正筛选磁珠上的细胞洗脱下来以及HBG1抗体标记磁珠,用于对洗脱下的细胞进行再次正筛选。本发明大大提高了分离靶细胞的得率和纯度,为后续的各种分析奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于细胞生物学检测领域,具体而言涉及一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法及试剂盒。本发明可以应用于产前基因或染色质检查。

背景技术

随着现代医学发展和医疗技术的进步,医疗卫生水平的发展,感染性疾病已经得到了较好的控制,人们的平均寿命不断延长,而遗传性疾病(基因病或染色体病)由于在医学上尚无有效的治疗办法,在严重威胁人们健康的疾病中地位越来越重要,给家庭和社会带来了极大的精神负担和经济损失,因而进行产前诊断从而避免患儿出生成为控制遗传性疾病发生,降低人群遗传负荷,提高遗传素质的重要途径。

产前诊断能够识别先天性的出生缺陷及遗传缺陷,有助于早期介入从而避免并发症并减轻父母的担忧。用于染色体和单基因病的产前诊断的胎儿细胞通常采用羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样和脐穿刺获得,为有创取材,带有虽小而固有的流产的危险(0.5-4%),患者依从性较差。近年来发现母体外周血中的某些成分可以用来检测胎儿疾病状况,来自孕早期母体血液中的胎儿细胞或DNA有望成为目前的产前诊断方法的无创伤性替代方案。但母体循环中的无细胞DNA片段小,含量低,不足以提供用于诊断的完整的染色体信息(例如,异倍体),因而母体循环中的胎儿细胞是用于无创检测染色体异常的希望所在,但其细胞数量很少,尤其是其细胞特性又与母体细胞相近,难以与母体细胞截然区分。目前无创产前诊断的主要限制因素是缺乏有效的分离纯化母体外周血中胎儿细胞的技术。利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断因对于胎儿没有任何风险,对孕妇无痛苦,易被接受、推广,近年来研究十分活跃,是遗传病产前诊断的发展方向。因此建立无创性产前诊断取材方法,降低产前诊断的风险是产前诊断工作的一项重大课题。

孕妇外周血存在胎儿细胞已被国内外许多研究所证实。孕妇外周血中胎儿细胞包括胎儿有核红细胞(Nucleated red blood cell、NRBC)、胎儿淋巴细胞、胎儿滋养细胞及粒细胞,可见通过胎盘屏障进入母体循环的胎儿细胞是一个混合群体。将适宜于进行产前诊断的靶细胞从母体外周血中分离出来是实施无创伤性产前诊断的必要条件。目前国内外学者的研究集中在胎儿有核红细胞上,并一致认为胎儿有核红细胞是最佳的靶细胞。原因是NRBC具有如下可资利用的优点:(1)可在妊娠早期出现,且在母体外周血中的寿命短(不超过90天),便于早期诊断且不被前次妊娠干扰;(2)可表达出特殊的抗原成分,便于富集;(3)可发生特殊的血红蛋白反应,便于鉴定;(4)携带胎儿全部遗传信息(基因组),便于遗传学和分子生物学分析。国内外学者大多利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体,经流式细胞计数仪分离纯化胎儿细胞,但这些NRBC绝大多数为母源性,胎源性NRBC比例很低。有研究表明,母体外周血单核细胞经过CD45标记磁珠负筛选,剩余细胞再采用CD71抗体标记的磁珠正筛选能够获得一定量的胎儿有核红细胞,但已有方法无论在得率或者胎儿有核红细胞纯度方面都有不足。Reading等报道用1.083和1.090g/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离,经FISH和γ珠蛋白单抗标记后进行FACS证实,高密度梯度的分离液可显著提高胎儿细胞的产量,但得率也有不足。

综上所述,目前国内外关于这方面的研究都存在胎儿细胞富集、分离的数量少,纯度不够,操作过程复杂,并且应用于产前诊断的疾病范围非常有限,使得该项工作没有实质性的突破。因此建立一套稳定可靠、操作简便、富集力强、分离纯度高的富集和分离胎儿有核红细胞的新方法,并可用于产前多种遗传性疾病的诊断,具有重要现实意义。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题,本发明提供了胎儿有核红细胞的分离纯化方法及试剂盒。

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