[发明专利]一种细胞冻存液及冻存方法

说明书

本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及冻存方法，细胞冻存液包括甲基纤维素、麦芽糖、DMSO、人血白蛋白、右旋糖酐、L‑丝氨酸、i‑肌醇和氯化钠注射液，本发明的细胞冻存液中，DMSO可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤；甲基纤维素作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；麦芽糖具有良好的抗结晶性，防止冰晶对细胞的损伤。通过上述原料的组合，可以最大程度上防止冰晶对细胞的损耗，并且尽可能地降低了DMSO的含量，因而对PBMC或干细胞或T淋巴细胞等细胞具有较好的保护能力，存活率高。

技术领域

本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及冻存方法。

背景技术

目前，在细胞冷冻保存领域中，为保护细胞免受冷冻损伤，人们广泛采用的是在冻存液中添加冷冻保护剂(CPA)。而二甲基亚砜(DMSO)是细胞冷冻保存中最常用的冷冻保护剂，但过高浓度的DMSO对细胞存在一定的毒性，会引起细胞内蛋白变性，因而不适的DMSO浓度选择会对细胞的保存有着很大影响。现有冻存液冻存的细胞复苏后活细胞得率较少，冻存液对细胞损伤很大，会直接导致细胞死亡。冻存过程中降温方法对细胞存活影响很大，现有技术没有严格控制，致使降温过程细胞死亡率提升。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种细胞存活率高的细胞冻存液及冻存方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种细胞冻存液，包括如下原料：

余量为氯化钠注射液。

本发明的细胞冻存液中，DMSO在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤；甲基纤维素作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；麦芽糖具有良好的抗结晶性，防止冰晶对细胞的损伤；人血白蛋白作为冻存稳定剂，有利于在细胞复苏过程中调节渗透压，防止冻存和复苏时因为渗透压剧烈变化增加细胞死亡率；右旋糖酐可以维持渗透压和pH值，提供适宜细胞生存的理化环境；丝氨酸可以提高细胞活性，增加抗冻存伤害能力，维持冻存过程细胞状态良好；i-肌醇是细胞的生长因子，维持冻存细胞终状态良好。

本发明通过上述原料的组合，可以最大程度上防止冰晶对细胞的损耗，并且尽可能地降低了DMSO的含量，因而对PBMC或干细胞或T淋巴细胞等细胞具有较好的保护能力，存活率高。

其中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。

一种细胞冻存方法，包括如下步骤：

(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；

(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；

(3)重复步骤(2)1-2次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；

(4)在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下孵育30-60min；

(5)进行离心，弃上清；

(6)用细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；

(7)用细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；

(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；

(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。

其中，所述步骤(1)中的离心条件为23-25℃，15-20min，400-600g。