[发明专利]分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用，该试剂包括裂解液A：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，9mM‑11mM NaCl，0.5 mM EDTA，1mM‑2mM MgCl₂；裂解液B：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，pH 7.8，9mM‑11mM NaCl，0.5 mM EDTA，1mM‑2mM MgCl₂，8%‑12%NP‑40；裂解液C：pH为7.8的6mM‑12mM HEPES，9mM‑11mM NaCl，0.5 mM EDTA，1mM‑2mM MgCl₂，8%‑12%甘油，8%‑12%SDS。本发明能够实现高效、快速、完全的分离细胞浆蛋白和核蛋白，避免二者交叉污染。

技术领域

本发明涉及蛋白分离技术领域，特别是涉及一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用。

背景技术

细胞核浆蛋白分离试剂是用于提取细胞中蛋白的试剂。医学研究中常用的细胞蛋白为细胞浆蛋白和细胞核蛋白；由于细胞内渗透压高，通常使用渗透压低的裂解液破坏细胞膜，当细胞膜被裂解后，细胞浆蛋白会渗出；高盐可破坏细胞的核膜，在高盐环境中，细胞核膜被破坏，核蛋白就可释放出来；因此，细胞核浆蛋白分离技术的关键在于借助不同渗透压的试剂，有效分离细胞浆和细胞核蛋白，即浆蛋白提取液中不能含有核蛋白，且核蛋白提取液中不能含有浆蛋白，以便分别用于检测和研究细胞浆和细胞核中分布的相关蛋白等。

然而，现有技术中存在以下缺陷：细胞浆蛋白分离时，由于裂解液裂解的强度太大或时间太长，导致细胞核膜的破坏和核蛋白溢出；细胞浆蛋白去除不充分，导致细胞核蛋白中残留浆蛋白污染；蛋白分离液成分中含细胞毒性很强的蛋白酶抑制剂如苯甲基磺酰氟（PMSF），毒性强，会导致细胞损伤，给操作人员的健康带来危害；蛋白裂解液含易氧化的还原剂成分如二硫苏糖醇（DTT），导致裂解液保存的稳定性差。

发明内容

鉴于上述状况，本发明提供一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂、制备方法及应用，以解决现有试剂在分离细胞浆蛋白和核蛋白时会导致二者交叉污染、试剂毒性强、保存稳定性差的问题。

本发明的技术方案为：

一种分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂，包括裂解液A、裂解液B和裂解液C，裂解液A的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸），9mM-11mM NaCl，0.5mM EDTA（乙二胺四乙酸），1mM-2mM MgCl₂；裂解液B的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，pH 7.8，9mM-11mM NaCl，0.5 mM EDTA，1mM-2mM MgCl₂，8%-12%NP-40（乙基苯基聚乙二醇）；裂解液C的成分为：pH为7.8的6mM-12mM HEPES，9mM-11mM NaCl，0.5 mM EDTA，1mM-2mMMgCl₂，8%-12%甘油，8%-12%SDS（十二烷基硫酸钠）。

本发明还提供了上述分离提取细胞中浆蛋白和核蛋白的试剂的制备方法，包括：

步骤1：制备裂解液A；

步骤2：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液B；

步骤3：得到裂解液A后，在裂解液A基础上制备裂解液C；

其中，所述步骤1具体包括：

步骤1.1：配制HEPES溶液，浓度为6mM-12mM；

步骤1.2：配制NaCl和MgCl₂两种盐溶液，NaCl的浓度为9mM-11mM，MgCl₂的浓度为1mM-2mM；

步骤1.3：配置EDTA溶液，EDTA溶液的浓度配制成0.5 mM；