[发明专利]一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用

说明书

本发明公开了一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用，包括提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序，序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选后测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记，筛选得到的欧山羊草引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。本发明可用于小麦背景下欧山羊草染色体、染色体片段等遗传成分的检测，通过简化基因组测序技术，可大规模快速地对小麦‑欧山羊草衍生系材料进行检测，且省时省力，花费少。

技术领域

本发明属于分子标记筛选技术领域，具体涉及一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用。

背景技术

山羊草属(Aegilops L.)是小麦近缘植物中与小麦亲缘关系最为密切的属，在小麦进化中起着重要作用，并为小麦改良提供了一批优良基因。山羊草属由11个二倍体，10个四倍体和2个六倍体组成(Van Slageren,1994)，包括C、D、N、M、S和U基因组(Mirzaghaderiand Mason 2019)。欧山羊草(Ae.biuncialis，2n ＝4x＝28,UUMM)携带有抗旱、耐盐、抗病等优异基因，但目前，关于欧山羊草特异分子标记开发与检测进展较少。从108个小麦 SSR标记中筛选到2个分子标记(GWM44和GDM61)可用于欧山羊草 2M^b和3M^b染色体的检测；筛选到少数U和M基因组特异的COS (conserved orthologous set)标记；从48个PLUG标记当中筛选到5个欧山羊草1U^b特异的分子标记，以上报导均是利用已有的小麦分子标记信息开发而来，且开发效率低。同时，这些标记远远无法满足小麦背景下，欧山羊遗传成分的鉴定与检测。

目前，尚未见有关欧山羊草特异分子标记及其开发的报道,欧山羊草特异分子标记的获得，可用于小麦背景下欧山羊草染色体、染色体片段等遗传成分的检测，可大规模快速地对小麦-欧山羊草衍生系材料进行检测，且省时省力，花费少。尚未见利用简化基因组测序技术进行欧山羊草特异分子标记的开发，本专利证实该方法可以高效用来开发欧山羊草特异分子标记，因此需要一种简化基因组测序技术大规模快速地小麦-欧山羊草衍生系材料进行检测欧山羊草特异分子标记获取方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用，为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：

本发明包括以下步骤：

A提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序；

B序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选；

C测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记；筛选得到的欧山羊草(U和M基因组)引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上。

D以小麦属植物基因组DNA为阴性对照，欧山羊草基因组DNA为阳性对照，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。

进一步地，扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1 μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的Taq PCR Mix，2μl 的ddH₂O；PCR扩增程序为：

(1)94℃变性4min，

(2)35个循环的普通PCR程序：94℃变性1min，58℃复性1 min，72℃延伸1min；

(3)72℃延伸5min；结束扩增，15℃保存；