[发明专利]人源GLUT5稳定转染细胞株及其在筛选GLUT5抑制剂中的应用

权利要求书

1.一种人源GLUT5稳定转染细胞株，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：

(1)将hGLUT5目的基因与pcDNA3.1/G418(+)Ampicillin表达载体组装，构建pcDNA3.1/G418(+)-hGLUT5质粒；其中，hGLUT5目的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的质粒转染至HEK293细胞，细胞转染24h后，使用G418抗生素筛选出阳性克隆，并通过使用阳性化合物进行转运或代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达GLUT5基因及其蛋白，即构建出所述人源GLUT5稳定转染细胞株。

2.根据权利要求1所述的人源GLUT5稳定转染细胞株，其特征在于：在步骤(1)中，构建质粒时所采用的内切酶为5’端KpnI和3’端XhoI限制性内切酶。

3.根据权利要求1所述的人源GLUT5稳定转染细胞株，其特征在于：在步骤(2)中，质粒转染时，质粒的浓度为0.001μg/μL。

4.根据权利要求1所述的人源GLUT5稳定转染细胞株，其特征在于：在步骤(2)中，G418抗生素的浓度为800μg/mL。

5.根据权利要求1所述的人源GLUT5稳定转染细胞株，其特征在于：在步骤(2)中，G418抗生素筛选时，细胞融合度超过25％时，立即传代，每3-4天更换含G418抗生素的培养液进行培养，重复以上步骤，直至传代至3-4代，挑选出阳性单克隆继续培养至长成细胞株。

6.权利要求1-5中任一项所述的人源GLUT5稳定转染细胞株在筛选GLUT5摄取转运果糖的抑制剂中的应用。

7.一种筛选GLUT5摄取转运果糖的抑制剂的方法，其特征在于，采用权利要求1-5中任一项所述的人源GLUT5稳定转染细胞株进行，包括以下步骤：

(S1)将权利要求1-5中任一项所述的人源GLUT5稳定转染细胞株和Mock细胞在高糖培养基中进行培养，当细胞生长至75％～85％进行铺板于多聚赖氨酸包被过的孔板中；

(S2)将高糖培养液替换为无糖DMEM，并采用无糖DMEM配制的待测化合物溶液进行预孵育，以去除培养环境中葡萄糖的影响；然后向预孵育环境中加入底物果糖和待测化合物进行孵育，孵育终止后，去除孵育液并洗净孔板以去除培养环境中果糖的影响；其中预孵育前后加入的是同一种待测化合物；

(S3)检测每孔细胞内果糖的含量和蛋白浓度，再将每孔细胞内果糖的含量用蛋白浓度进行归一化处理，计算细胞对果糖的摄取转运速率，若待测化合物对GLUT5摄取转运果糖的产生抑制作用，即筛选出GLUT5摄取转运果糖的抑制剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(S1)中，细胞铺板时密度为2×10^5/孔，铺板时细胞培养液为含有10％胎牛血清的高糖DMEM。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(S2)中，无糖DMEM的浓度为450μL；预孵育过程中，待测化合物的终浓度为100μM；孵育时，底物果糖的终浓度为3mM。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(S3)中，检测每孔细胞内果糖的含量和蛋白浓度的方法包括以下步骤：

每孔取细胞破碎溶液，加入含内标倍他米松的溶液，涡流后沉淀蛋白，然后取上清液进行LC-MS/MS分析，以检测每孔细胞内果糖的含量；

另外每孔取细胞破碎溶液，使用TaKara的BCA试剂盒，以检测每孔细胞内的蛋白浓度。