[发明专利]人源GLUT5稳定转染细胞株及其在筛选GLUT5抑制剂中的应用

说明书

本发明涉及一种人源GLUT5稳定转染细胞株及其在筛选GLUT5抑制剂中的应用。本发明在通过使用基因合成、分子生物学等技术成功构建人源GLUT5稳定转染细胞株的基础上，公开了其筛选GLUT5抑制剂的应用和方法，为寻找GLUT5选择性抑制剂找到了新途径。

技术领域

本发明涉及细胞株构建及GLUT5转运体抑制剂筛选技术领域，尤其涉及一种人源GLUT5稳定转染细胞株及其在筛选GLUT5选择性抑制剂中的应用。

背景技术

正常细胞的代谢，通常以葡萄糖作为基础物质，进入三羧酸循环，产生ATP提供能量，并形成碱基、氨基酸、脂质等构成生物大分子的基本单元，维持氧化还原的平衡，实现并完成生理功能。而肿瘤细胞的代谢，糖生成丙酮酸后，主要进入糖酵解产生能量，即使在氧气充足的情况下，也是通过糖酵解这样一种耗时短但产能率低的途径，这种现象在肿瘤学上被称之为沃尔伯格效应(Warburg effect)。肿瘤细胞由于生长周期失控，持续地分裂与增殖需要消耗大量的能量以及糖，因此，糖进入肿瘤细胞的过程(基本单元供给)十分重要。由于细胞膜是非极性脂肪膜(nonpolar lipid bilayer)，而糖分子是极性分子，糖进入肿瘤细胞的过程，除了少量的被动扩散，主要依赖于特异的糖转运蛋白的摄取转运作用。

糖转运体属于SLC2基因家族，根据其生理功能的差别可分为三类：(1)血细胞、脂肪组织和骨骼肌中转运6元环糖葡萄糖，如SLC2A1(GLUT1)；(2)转运5元环果糖，如果糖特异性的转运体SLC2A5(GLUT5)；(3)双功能GLUT7和GLUT11，既能转运6元环糖葡萄糖如葡萄糖也能转运5元环果糖如果糖。

肿瘤细胞细胞周期失控，持续地分裂与增殖需要消耗大量的能量；这种代谢重编程如沃尔伯格效应所揭示：肿瘤细胞往往采用产能率较低的糖酵解途径，势必消耗更多的葡萄糖，导致肿瘤生长过程中葡萄糖缺失。在这种情况下，肿瘤细胞将出现果糖替代机制，即以果糖弥补葡萄糖缺失提供能量来源。研究证明，果糖的使用会造成肿瘤细胞增殖加快，克隆形成变多，浸润性更强，表现出多种肿瘤恶化的细胞特性。因此，在葡萄糖供应不足的肿瘤细胞中，阻断或减少果糖的摄取，可能达到抑制住肿瘤细胞生长增值的作用。基于这个假设，将果糖特异性转运体GLUT5作为潜在新型靶点，探讨通过调控GLUT5转运功能治疗癌症的可能性。

GLUT5是特异性转运果糖的转运体，该转运体抑制剂的设计及筛选可以通过某些表达GLUT5的肿瘤细胞完成。但这种筛选方法具有特异性差、通量低、成本高的缺点，因此建立以稳定表达人源性GLUT5的细胞株为工具的抑制剂筛选体系意义重大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种人源GLUT5稳定转染细胞株及其在筛选GLUT5抑制剂中的应用，本发明在通过使用基因合成、分子生物学等技术成功构建人源GLUT5稳定转染细胞株的基础上，公开了其筛选GLUT5抑制剂的应用和方法，为寻找GLUT5抑制剂找到了新途径。

本发明的第一个目的是提供一种人源GLUT5稳定转染细胞株，其构建方法包括以下步骤：

(1)将hGLUT5目的基因与pcDNA3.1/G418(+)Ampicillin表达载体组装，构建pcDNA3.1/G418(+)-hGLUT5质粒；其中，hGLUT5目的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)采用脂质体法将步骤(1)构建的质粒转染至HEK293细胞，细胞转染24h后，使用G418抗生素筛选出阳性克隆，并通过使用阳性化合物进行转运或代谢功能验证，确认细胞株同时稳定表达GLUT5基因及其蛋白，即构建出所述人源GLUT5稳定转染细胞株。

进一步地，在步骤(1)中，hGLUT5目的基因合成方法为：从基因库获得SLC2A5基因序列(NM_001328619.2)，采用合成生物学方法合成该基因。与传统的基因克隆技术相比，合成生物学具有快速、准确、高效等特点，在构建基因表达体系时更具有优势。