[发明专利]单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法

说明书

本发明提供一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，所述方法包括在Transwell嵌套上室铺设胶原蛋白，并调整奶牛乳腺上皮细胞的培养基组成及培养时间。相较于现有的细胞培养方法，本发明成功构建了奶牛乳腺上皮屏障模型，可在研究奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用等方面广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法。

背景技术

在哺乳动物乳腺中，乳腺上皮细胞是乳腺表层的第一层细胞，不仅可以分泌乳汁还能对大肠杆菌等抗原产生先天性免疫反应。

相邻的乳腺上皮细胞通过细胞连接复合体连接在一起，细胞连接复合体包括紧密连接(Tight junction，TJ)、粘附连接(Adhesion junction，AJ)和桥粒(Desmosome)。其中紧密连接位于上皮细胞最顶端的连接复合物，呈连续的带状结构，使相邻的上皮细胞互相紧密连接，限制水分子、离子、水和微生物的胞旁流动，是血乳屏障的重要组成部分。桥粒是一种坚韧、牢固的细胞连接结构，通过与中间纤维形成的网络支架相连，使相邻的细胞连接成一体，可以承受很大的拉力，且桥粒本身即具有很强的抗牵张力，使得细胞间的连接更为牢固。

乳房炎是哺乳动物常见的一种危害较大的临床性疾病，奶牛乳腺感染细菌会扰乱其乳腺上皮细胞正常分泌乳汁的功能，导致乳汁中断。急性乳房炎常常损伤血乳屏障，而屏障功能被破坏后，乳汁中的成分如α-乳清蛋白和酪蛋白会进入血液，血液中的成分也会进入乳汁。因此，亟需开发一种新的细胞培养方法，用于奶牛乳腺上皮屏障模型的构建。单层细胞跨膜电阻值(Trans Epithelial Electric Resistance，TEER)用于评价单层细胞的完整性，通常认为TEER值在达到400Ω·cm²时即表明形成了致密的单层细胞。

发明内容

本发明旨在利用奶牛乳腺上皮细胞，提供一种新的单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，在为研究奶牛患乳房炎时乳腺组织被破坏的机理、乳汁物质运输及不同物质对乳腺上皮屏障的保护作用提供一种致密的单层奶牛乳腺上皮细胞模型。

为了实现本发明目的，本发明提供一种单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法，将奶牛乳腺上皮细胞接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板中，随后进行两阶段的细胞培养，即奶牛乳腺上皮细胞接种后48h内采用培养基1进行培养，随后72h采用培养基2进行培养。

其中，培养基1为含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、15ng/mL人表皮生长因子、1％ITS的DMEM/F12培养基。其中，％是指体积百分数。

培养基2为含有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和1％ITS的DMEM/F12培养基。

ITS为含有1g/L胰岛素、0.55g/L转铁蛋白、0.00067g/L亚硒酸钠的溶液。即，ITS溶液(100×)，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

前述的方法，将奶牛乳腺上皮细胞以10⁴～10⁵个/孔(优选2×10⁴个/孔)接种于上室铺设有胶原蛋白的带膜Transwell嵌套多孔板的上室中，于37℃、5％CO₂条件下培养。

前述的方法，采用培养基1进行培养时，每24h更换一次培养基。

前述的方法，采用培养基2进行培养时，每48h更换一次培养基。

前述的方法，所述胶原蛋白的浓度为0.012mg/mL。

优选地，所述胶原蛋白为鼠尾胶原蛋白(鼠尾胶原)，用于包被多孔板的胶原蛋白溶液以0.36g/L乙酸溶液进行配制。

优选地，所述带膜Transwell嵌套多孔板为12孔板。