[发明专利]人源Tsg101-Vps28-Vps37-Mvb12A四元复合物的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及人源Tsg101‑Vps28‑Vps37‑Mvb12A四元复合物的制备方法及应用。通过分别针对人源Tsg101、Vps28、Vps37和Mvb12A设计截短体；获取组成人源ESCRT‑I复合物的四种亚基的截短体编码序列片段；分别克隆至昆虫表达载体并转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid杆粒；将四种重组杆粒分别转染sf9昆虫细胞产生重组杆状病毒并扩增至P2代病毒储液，将四种P2代病毒等比例感染sf9细胞进行目的蛋白表达；经层析纯化获得人源ESCRT‑I四元复合物。该复合物为解析ESCRT‑I复合物结构及阐释ESCRT‑I复合物介导膜出芽机制奠定基础。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及人源Tsg101-Vps28-Vps37-Mvb12A四元复合物的制备方法及应用。

背景技术

转运必需内体分选复合物(ESCRT)系统是真核细胞中介导膜重塑和剪切事件的分子机器装置，负责分选泛素化修饰的膜蛋白进入多泡小体(MVB)中，进而继续被输送到溶酶体中进行降解。此外，作为多功能的分子机器，ESCRT系统还参与胞质分裂、包膜病毒出芽、细胞质膜损伤修复、核孔复合体的质量控制及核膜重新形成等多个重要生物学过程。哺乳动物细胞的ESCRT系统由ESCRT-0、I、II、III和VPS4-LIP5等5个复合物以及包括ALIX/AIP1等在内的一些辅助蛋白组成，关于这些复合物结构和功能的研究已成为生命科学研究中的热点领域之一。

ESCRT-I复合物最初是在鉴定酵母细胞中MVB生物发生必需因子的遗传筛选研究中被限定的，是第一个被发现的ESCRT系统的复合物组分。ESCRT-I可以直接结合泛素分子，也可以直接与拥有多个泛素化结合结构域因而被认为在泛素化的膜蛋白结合和分选的最初阶段起作用的ESCRT-0异二聚体复合物相结合，同时ESCRT-I的另一端可以结合来自于ESCRT-II/III的组分，因而在ESCRT介导的逆拓扑学上的膜分离过程中起着关键的接头作用。特别地，HIV-1等逆转录病毒从靶细胞中出芽主要也是通过ESCRT-I复合物。胞质分裂同样需要招募ESCRT-I复合物到两个子代细胞之间最后的连接处——中间体。这些重要的生物学功能使得ESCRT-I成为了结构生物学研究的焦点和抗病毒药物研发的靶点。

对ESCRT-I复合物研究的很大一部分兴趣源于其在HIV和人类T淋巴细胞白血病病毒HTLV等逆转录病毒出芽过程中的关键作用。鉴于此，对人源ESCRT-I复合物研究的一个很重要的目标就是研发针对此复合物的抗艾滋病药物，这也迫切需要高分辨率的人源ESCRT-I复合物的结构信息作为指导。这样就需要足量均一稳定的ESCRT-I复合物重组蛋白。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了人源Tsg101-Vps28-Vps37-Mvb12A四元复合物的制备方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，人源Tsg101-Vps28-Vps37-Mvb12A四元复合物的制备方法，包括：分别针对Tsg101、Vps28、Vps37和Mvb12A设计截短体；获取组成人源ESCRT-I复合物的四种亚基的截短体编码序列片段；分别克隆至昆虫表达载体中，并分别转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid杆粒；将四种重组Bacmid杆粒等比例转染sf9昆虫细胞产生杆状病毒并扩增至P2代病毒储液，将四种P2代病毒等比例感染sf9细胞进行目标蛋白的表达；经两步层析纯化获取人源ESCRT-I四元复合物。

进一步地，Tsg101、Vps28、Vps37和Mvb12A的截短体氨基酸序列分别见序列表SEQID No.1-SEQ ID No.4所示。

进一步地，编码Tsg101、Vps28、Vps37和Mvb12A的截短体氨基酸的碱基序列分别见序列表SEQ ID No.5-SEQ ID No.8所示。