[发明专利]一种土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的引物和试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的引物和试剂盒，以及利用该引物对土壤中反硝化细菌nirS基因进行绝对定量检测的方法。所述引物的正向引物序列与GCAGCCCGAGTACAACAAG具有至少85％的同源性，反向引物序列与TCCAGACCGAGAACCACAC具有至少85％的同源性。采用本发明的引物，扩增效率高，并且可以扩增更多硝化细菌的nirS基因。采用本发明的试剂盒对土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测，操作方便，速度快，精确度高。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及生物的分子检测，更具体涉及一种土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的引物和试剂盒。

背景技术

反硝化作用是反硝化细菌在无氧或者微氧环境下催化NO₃^-，最终生成N₂的过程。氧化亚氮还原酶基因(nirS)参与反硝化反应过程中NO₃^-→NO₂^-→NO→N₂O→N₂中NO₂→NO的转化。目前已经发现的反硝化细菌包括了苍白杆菌属(Ochrobacturum)、假单胞菌属(Pseudomonaceae)、假单胞菌属(Pseudomonaceae)、无色杆菌属(Achrombacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、苍白杆菌属(Ochrobacturum)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)等。由于反硝化细菌种类较多，可以使用16S rRNA高通量测序的方法研究反硝化细菌的多样性，但是在研究细菌的拷贝数时，此方法存在通量低，速度慢，费用高等问题。亚硝酸盐还原酶是反硝化作用的一个重要酶，存在两种编码亚硝酸盐还原酶的基因，分别是nirK和nirS。可以通过定量PCR的方法检测土壤中nirS基因的拷贝数，从而比较不同土壤在生物脱氨过程中的差异。目前用于nirS基因定量PCR检测的引物(F：TCGCCSATYCCGGCSATGTC和R：GAGTTGTACCAGTCRGCSGAYTCSG)存在较多的兼并碱基，扩增产物长度在170bp左右，兼并碱基过多严重影响引物的扩增效率。陈娜等(2019)使用正向引物序列为GTSAACGTSAAGGARACSGG，反向引物序列为GASTTCGGRTGSGTCTTGA的引物进行土壤中nirS基因的实时定量PCR检测；扈培龙(2015)使用的引物的正向引物序列为TACCACCCCGAGCCGCGCGT，反向引物序列为GCCGCCGTCRTGVAGGAA，但是上述这些定量PCR检测引物或存在较多的简并碱基，或扩增长度较长，影响了扩增效率，并不适合用于定量PCR检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种无简并碱基且扩增长度更短的，用于土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的引物和试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的引物，所述的引物的正向引物序列与GCAGCCCGAGTACAACAAG(SEQ ID NO：1)具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少94％的同源性；反向引物序列与TCCAGACCGAGAACCACAC(SEQ ID NO：2)具有至少85％的同源性，优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少94％的同源性。

优选地，所述的引物的正向引物序列为GCAGCCCGAGTACAACAAG(SEQ ID NO：1)，反向引物序列为TCCAGACCGAGAACCACAC(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供一种用于土壤中反硝化细菌nirS基因绝对定量检测的试剂盒，所述的试剂盒包括任一项本发明中所述的引物。

优选地，所述的试剂盒还包括进行定量PCR检测时所需的试剂，具体实施时，操作更加方便、快速。