[发明专利]绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用

权利要求书

1.一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；

S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；

以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中包括：

S11、诱导绿色荧光蛋白表达，并对绿色荧光蛋白进行纯化；

S12、建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株，注射至实验动物体内后收集腹水，且在纯化腹水后获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S11包括：S111、将表达载体转入宿主细胞内，通过化学方法和/或物理方法诱导绿色荧光蛋白表达；S112、对诱导表达的绿色荧光蛋白进行纯化。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S12包括：S121、选取实验动物，且将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫，且在完成动物免疫后取实验动物脾组织；

S122、用PEG将实验动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性融合细胞株，且在对阳性融合细胞株进行亚克隆后进行筛选，待亚克隆阳性率达到100％时建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株；

S123、取实验动物，且每只注射0.5ml石蜡油，7天后取绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株细胞重悬于无血清培养基中，按1×10⁶个细胞/0.5ml/只的剂量注射至注射有石蜡油的实验动物体内，注射7-14天后收集腹水；

S124、腹水进行离心去杂后过Protein G琼脂糖凝胶柱，洗脱后中和至中性，浓缩后即获得一个绿色荧光蛋白单克隆抗体；

以及S125、重复步骤S121-S124，直至获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S121中，将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫的步骤包括：

初免：按200μg抗原/只的剂量在实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式完全佐剂乳化；

二免：初免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化；

三免：二免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S121中，将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫的步骤还包括：

四免：三免7-10天后，按100μg抗原/只的剂量在同一实验动物体内注射抗原溶液，此抗原溶液用同体积的弗式不完全佐剂乳化。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

S21、取Protein G磁珠，离心后去上清，PBS缓冲液洗2-3次后再用PBS溶液重悬，再加入层析柱中；

S22、待层析柱中的PBS缓冲液从底部出口流出后，在层析柱中加入0.5-1.5mg绿色荧光蛋白单克隆抗体，盖上层析柱盖子后于4℃摇床孵育过夜；

S23、过夜后用PBS缓冲液对绿色荧光蛋白单克隆抗体清洗2-3次，排出PBS缓冲液后再加入DMP溶液，20-25℃下孵育25-35min；

S24、排出DMP溶液后分别用0.2M三乙醇胺洗2-3次、50mM乙醇胺洗1-2次、1M甘氨酸溶液洗1-2次，以去除游离抗体；再用PBS缓冲液平衡层析柱后即获得与一个绿色荧光蛋白单克隆抗体对应的免疫亲和柱；

以及S25、重复步骤S21-S24，以获得N个免疫亲和柱。