[发明专利]绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用

说明书

本发明公开了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其包括如下步骤：S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。其运用多个免疫亲和柱对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，再通过该目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱对绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，以提高纯化效率和效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用。

背景技术

蛋白质的结构、功能等性质研究需要获得大量高纯度蛋白。其中，异源表达重组蛋白并进行目的蛋白的纯化是获得大量高纯度蛋白的常用方法。荧光蛋白作为融合蛋白标签，不仅在抗体制备中可以提高蛋白的免疫原性，而且通过观察细胞裂解液颜色就可以判断重组蛋白是否表达。

由于亲和层析操作简单、纯化效果好，成为最常用的重组蛋白纯化方法。不同的融合标签有不同的纯化方法。如，组氨酸标签(6×his)融合蛋白可通过金属离子螯合亲和层析进行纯化；GST融合蛋白可通过酶与底物结合的专一性进行亲和纯化；MBP融合蛋白通过麦芽糖结合蛋白与麦芽糖的特异结合进行亲和纯化。但对于绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)目前还没有合适的纯化方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法、免疫亲和柱及其运用，其运用多个免疫亲和柱对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱，再通过该目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱对绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，以提高纯化效率和效果。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

提供了一种绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱的制备方法，其包括如下步骤：

S1、制备N个绿色荧光蛋白单克隆抗体，N为正整数；

S2、针对每一所述绿色荧光蛋白单克隆抗体制备与其对应的免疫亲和柱，以获得N个免疫亲和柱；

以及S3、运用N个免疫亲和柱中的一个或多个对同一绿色荧光蛋白融合蛋白进行纯化，选取纯化效果达到预期值的免疫亲和柱作为目标绿色荧光蛋白融合蛋白免疫亲和柱。

优选的，所述步骤S1中包括：

S11、诱导绿色荧光蛋白表达，并对绿色荧光蛋白进行纯化；

S12、建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株，注射至实验动物体内后收集腹水，且在纯化腹水后获得N个绿色荧光蛋白单克隆抗体。

优选的，所述步骤S11包括：S111、将表达载体转入宿主细胞内，通过化学方法和/或物理方法诱导绿色荧光蛋白表达；S112、对诱导表达的绿色荧光蛋白进行纯化。

优选的，所述步骤S12包括：S121、选取实验动物，且将纯化后的绿色荧光蛋白作为抗原分阶段注射至实验动物体内，以完成动物免疫，且在完成动物免疫后取实验动物脾组织；

S122、用PEG将实验动物脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性融合细胞株，且在对阳性融合细胞株进行亚克隆后进行筛选，待亚克隆阳性率达到100％时建立绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株；

S123、取实验动物，且每只注射0.5ml石蜡油，7天后取绿色荧光蛋白单克隆抗体阳性杂交瘤细胞株细胞重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只的剂量注射至注射有石蜡油的实验动物体内，注射7-14天后收集腹水；