[发明专利]一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法

说明书

本发明提供了一种登革病毒通用型RT‑RAA‑LFD扩增引物及检测方法。本发明针对1～4型登革病毒的3'端非翻译区共同保守区域，设计了一对使用于RAA技术的特异性引物，正、反向引物的5'端分别用6‑羧基荧光素和生物素进行标记，这使得阳性的双链扩增产物的两端分别被标记上FAM和生物素。再利用包被了胶体金标记的抗FAM抗体和链霉亲和素的侧向流试纸，通过免疫层析法对扩增结果进行肉眼可视的判读，摆脱了对荧光定量仪器的依赖，最低检测浓度为10个拷贝/μL，与黄病毒科的其他病毒无交叉反应。将该扩增引物和方法用于临床样本，可成功检测出登革病毒RNA，与荧光定量PCR检测结果的一致性达到96％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及检测方法。

背景技术

登革热是当今全球范围内传播速度最快的虫媒传染病，它由1～4型登革病毒(Dengue virus,DENV)经伊蚊叮咬传播引起。在广东省地处亚热带，气候适宜蚊虫孳生，人口密度大，是我国登革热发病和传播的高发地区。2001年至2014年，我国大陆地区共报告56896例登革热，而仅仅广州市就发生了42530例，占全国发病人数的74.8％。疾病不仅给患者造成生理上的疼痛和心理上的压力，同时也给政府和个人带来了较高的经济负担。

目前临床使用的荧光定量PCR方法灵敏度高，但必须依赖精密控制温度的仪器，同时对实验环境、操作者的专业知识和技能都有较高的要求，在基层医院和社区门诊等处难以开展，使患者错过早发现早治疗的最佳时期，也不利于及时切断和隔离传染源。

重组酶辅助扩增(RAA)是一种利用UvsX、UvsY、SSB和聚合酶四种酶的新等温核酸扩增技术。寡核苷酸引物与UvsY，UvsX酶形成复合体，识别双链DNA中的同源序列，使双链DNA解链成单链。然后SSB与游离的单链结合，DNA聚合酶与UvsY，UvsX酶引物复合体结合后启动核酸扩增。RAA反应在35-45℃的条件下即可进行快速且特异的扩增。到目前为止，RAA可检测不同种类的细菌和病毒，已广泛应用于传染病诊断和食品污染测试。本发明旨在设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于设计一种登革病毒通用型RT-RAA-LFD扩增引物及相应的检测方法。

本发明通过RT-RAA核酸扩增技术实现核酸分子在常温下的快速扩增，利用FAM-抗FAM特异性抗体、链霉亲和素-生物素系统对扩增片段标记和特异识别，应用免疫层析法LFD对扩增产物进行可视化检测，建立一种易操作、耗时短的DENV核酸POCT(point-of-caretesting)检测技术，及时监测新发感染和预警重症病例，使传染源及早被切断，患者得到及时的治疗，最终降低感染的传播率与疾病死亡率。

本发明通过以下技术方案来实现：

一组基于恒温扩增RT-RAA-LFD技术的登革病毒通用型扩增引物，为如下所示：

RAA-F：5'-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；

RAA-R：5'-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。

所述的正、反向引物的5'端分别用6-羧基荧光素(FAM)和生物素进行标记。即引物对为如下：

RAA-F：5'-FAM-GGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTG-3'；

RAA-R：5'-biotin-GATCTCTGGTCTCTCCCAGCGTCAATATGCTGTT-3'。