[发明专利]一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法

说明书

本发明提供了一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法：先将富血小板血浆置于液氮中反复冻融，获得富细胞因子血浆；再于‑80℃预冻；然后放入‑45℃预冷的真空冷冻干燥机内，按照设定冻干程序进行冻干，获得冻干粉。本发明提供的的激活血小板释放细胞因子的方法为液氮反复冻融法，血小板激活彻底，释放的细胞因子量大；本发明获得冻干粉中细胞因子含量与冻干前样本中细胞因子含量基本相同，本发明提供的冻干方法可以最大程度保证细胞因子的活性。

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药领域，具体涉及一种富血小板血浆的分离、血小板的激活及富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法。

背景技术

创伤的修复与愈合是生物延续生命的必要手段。修复愈合的过程、方式与方法较为复杂，涉及许多细胞生长因子。目前已知的参与创伤愈合过程并起重要作用的有血小板衍生生长因子(PDGFs)、转化生长因子(TGF-β)和血管内表皮细胞生长因子(VEGF)等。过去十几年里，为加速创伤愈合，提高临床治疗效果，各种生长因子被广泛应用于口腔颌面外科、整形外科、骨科等医学领域。但以往多采用单一生长因子进行治疗研究，而创伤愈合是一个包括多种细胞因子参与的复杂的网络调控过程，故往往难以达到良好的修复效果。近年来，血液系统不同成分在骨再生和修复过程中所发挥的重要作用引起越来越多的关注。因此，作为一种多种生长因子重要来源的富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)引起了国内外学者的广泛关注。

富血小板血浆（PRP)是通过离心从新鲜全血中分离出的含有高浓度血小板的血浆，其血小板浓度是全血中血小板浓度的3-5倍，激活后有很高的生物活性，对促进组织的再生修复具有重要作用。近年来，随着相关研究的深入，由激活的PRP分泌的具生物活性的细胞因子的类型和确切作用被逐一阐明。这些因子主要包括血小板衍生因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growthfactor，VEGF）、转化生长因子（Transforming growth factor，TGF）、胰岛素样生长因子（Insulin growth factor，IGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生内皮生长因子（Platelet-derived endothelial growth factor，PDEGF）、骨钙素（Osteocalcin）和骨黏连蛋白（Osteonectin）等，这些细胞因子可与含有其受体的靶细胞，如间充质干细胞、成纤维细胞、内皮细胞、表皮细胞和成骨细胞等结合，发挥生物学作用。有关PRP实验研究表明，不但血小板及其细胞成分具有促丝裂原作用，而且血小板裂解后的上清液同样可显著促进成骨细胞的增殖作用。

血小板裂解液（platelet lysate，PL）是PRP经细胞裂解后进一步提纯的产物，不仅去除了残余细胞结构，降低了免疫原性，而且还保留了其中的多种生长因子，各生长因子的比例与体内正常比例相似，并具有最佳的协同作用，有助于创伤组织的修复。血小板裂解液中富含大量的细胞因子，细胞因子活性的保持比较局限，-80℃能够得到长期保存，但是，这种保存方法受到条件的限制。冷冻干燥的血小板因子冻干粉能够打破低温保存条件的限制，并且能够最大程度的保证细胞因子活性。

冷冻干燥技术在医药工业、食品工业、科研和其他部门均得到广泛的应用。此技术就是把含有大量水分的物质预先进行降温冻结成固体，然后在真空的条件下使水蒸气直接升华出来，而物质本身留在冻结时的框架中，因此干燥后体积不变。恰当的冷冻和干燥过程能够最大限度的保证样品活性。

综上所述，探索血浆血小板富集方法、血小板激活方法、富血小板释放细胞因子血浆的冻干方法，最大限度的保存血浆及血小板中细胞因子的活性是需要解决的问题。

发明内容

针对现有富血小板血浆冻干粉复溶后细胞因子活性低的问题，本发明提供一种富血小板细胞因子血浆冻干粉的制备方法，操作简单、得率高，而且获得的冻干粉活性好。