[发明专利]使用四甘醇单十烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法

说明书

本发明公开了一种使用四甘醇单十烷基醚进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法。所述方法先将纯化的膜蛋白复合物在C10E4存在下超滤脱盐，然后置换到含有C10E4的醋酸铵缓冲液中，并用含有C10E4的醋酸铵缓冲液透析进一步去除原始溶液中的表面活性剂，最后在相同的质谱条件下，分别对溶液中含有C10E4的膜蛋白复合物和蛋白质标准品进行质谱分析。本发明采用C10E4代替传统使用的表面活性剂DDM，大大降低膜蛋白的能态，有效维护膜蛋白的天然构象，从而可以快速而且准确地提供膜蛋白的结构生物学方面的信息，效果明显优于传统使用的表面活性剂DDM。

技术领域

本发明属于蛋白质结构生物学技术领域，涉及一种使用四甘醇单十烷基醚(Tetraethylene glycol monodecyl ether，C10E4)进行膜蛋白复合物的非变性质谱分析方法。

背景技术

膜蛋白承担着广泛的生物功能，一旦其功能失效，往往会引起严重的疾病，例如癌症等。虽然膜蛋白在人类基因组中只占有三分之一，但是目前一半以上的药物作用靶点都是膜蛋白。作为癌症和疾病的重要研究对象，膜蛋白以往是通过传统的结构生物学手段例如X光晶体衍射以及核磁共振对其结构开展研究。然而，膜蛋白重组表达往往因为其表达量和溶解性的难题导致其结构生物学研究难度重重。而且，对于常规的X光晶体衍射而言，晶体结构的分辨率不足以解析结合区域。

BtuCD是一类ABC转运蛋白，其生理功能是将水解ATP的能量用于耦合底物的跨膜转移。BtuCD包含两个用于水解ATP的核苷酸结合结构域(NBD)，利用水解ATP的能量控制跨膜区域的结构变化，从而实现维生素B12的转运过程。大肠杆菌BtuCD是II型ABC转运蛋白，它在结构和机制类似于转铁转运蛋白和血红素转运蛋白，其功能与某些革兰氏阴性病原体的毒力有关。BtuCD膜蛋白复合物常作为一种模式膜蛋白复合物用于膜蛋白研究。

非变性质谱是一种快速灵敏的分析方法，可以同时提供蛋白质复合物以及结合的小分子区域的结构信息。通常情况下为了维持膜蛋白的天然构象，高浓度的表面活性剂会被大量添加在溶液中，以至于形成了大小不一的表面活性剂胶束。由于这样的情况，膜蛋白一开始无法用于质谱方法分析，直到后来研究发现由十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecylβ-D-maltoside，DDM)表面活性剂包裹的膜蛋白可以被整体转移到气相。通过用高能量粒子轰击的办法，可以将表面活性剂分子从膜蛋白表面剥离，并且维持膜蛋白复合物各个亚基之间的相互作用。

膜蛋白质谱首先需要采用纳电喷雾的方法将含有表面活性剂的纯化后的膜蛋白质溶液离子化并转移到质谱仪中。这种质谱离子化的方法所获得的蛋白质喷雾主要成分是由带电荷膜蛋白复合物包裹着表面活性剂形成的。显然，在这种情况下是无法准确测量蛋白质复合物分子量的。因此需要通过热力学活化去除表面活性剂分子，这一目的的实现主要是通过提高碰撞活化过程的能量，随后通过四极杆质量分析器筛选出目标分子。加速离子使他们通过充满惰性气体的碰撞池，从而使得表面活性剂分子从蛋白质复合物上解离下来，从而将完整的蛋白质复合物无损地剥离出来。通过射频电导的进一步筛选，膜蛋白复合物离子被推进器转移到飞行时间质谱分析器。这样，膜蛋白复合物最终可以被微通道板探测器检测出来。

碰撞活化过程不仅仅可以将膜蛋白复合物从表面活性剂胶束中释放出来，提高能量的后果也包括膜蛋白复合物的解离。过高的活化能还会导致局部结构的坍塌，当能量越过某个阈值的时候，坍塌变性的蛋白质亚基甚至会从膜蛋白复合物中被抛射出来。由于母复合物电荷分离时的不对称分割，使得某个蛋白质亚基负载了过高的电荷，而余下的复合物只有很少的电荷。这种剥离有利于对带有较少电荷的复合物进行高分辨率分析，同时，剥离的结果也有利于膜蛋白亚基的化学计量研究以及多聚体蛋白质复合物的组成分析。