[发明专利]一种高效合成褪黑素的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高效合成褪黑素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌过表达色氨酸合成酶基因TRP5，敲除了吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述色氨酸合成酶基因TRP5，GenBank ID为852858；所述吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，GenBank ID为853541。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。

4.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)PCR扩增获得TRP5基因，然后将TRP5基因连接到质粒pYES2-ADH中，构建携带TRP5基因的重组质粒pYES2-ADH-TRP；

2)整合型重组质粒pYES2-ADH-TRP-rDNA的构建：以酿酒酵母第XII染色体上重复序列为模板，设计引物扩增获得rDNA作为同源重组的同源臂，将所述rDNA连接到步骤1)获得的pYES2-ADH-TRP重组质粒中，构建整合型重组质粒pYES2-ADH-TRP-rDNA，转化到酿酒酵母中得到过表达TRP5基因的重组酵母；

3)吲哚胺2,3-双加氧酶基因BNA2的敲除：采用Cre/loxP重组酶系统构建BNA2基因敲除组件，然后将所述BNA2基因敲除组件转化到步骤2)获得的重组酵母中，得到BNA2基因缺失菌株，然后去除所述缺失菌株中的抗生素抗性基因得到BNA2单倍体缺陷型菌株。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增所用的引物为：TRP5-F：CGCGGTACC ATGTCAGAACAACTCAGACAA，TRP5-R：CGCCTCGAGTTAGGCAGATGGGTCTTCTTC；扩增所用的模板为酿酒酵母BY4741基因组DNA。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述扩增获得rDNA的引物为：18S rDNA-F：CCGTACGTA ACAAAGGGCAGGGACGTAAT，18S rDNA–R：CCGTACGTACGGGGTATCTGTTTGGTGGA，扩增所用的模板为酿酒酵母BY4741基因组DNA。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述构建BNA2基因敲除组件时所用的左同源臂扩增引物为L-F：GCGCTTGGGTAGAAACAACA，L-R：TGTAGTACTTGTGGTCCGGT；所述构建BNA2基因敲除组件时所用的右同源臂扩增引物为R-F：TGCCTCATCTAAGACTATCGGA，R-R：TCTTTCTGGCCTCCTTGTCT，扩增所用模板均为酿酒酵母BY4741基因组DNA。

8.权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌在合成褪黑素中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述合成褪黑素的方法如下：将权利要求1-3任意一项所述的基因工程菌接种到SC-Ura选择性培养基中，28℃摇床培养，过夜活化，获得的种子液接种到发酵培养基中，28℃摇床培养9-21h，提取获得褪黑素。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述种子液接种到发酵培养基中，28℃摇床培养15h。