[发明专利]一种高效合成褪黑素的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种高效合成褪黑素的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。针对目前生物合成褪黑素产量低，耗时长的问题，本发明提供了一种高效合成褪黑素的基因工程菌，所述基因工程菌过表达色氨酸合成酶基因TRP5，敲除了吲哚胺2，3‑双加氧酶基因BNA2，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。利用本发明构建的基因工程菌合成褪黑素，合成效率明显提高，最高产量达到25.7mg/L，比原始菌株的产量提高了12倍之多。本发明可用于褪黑色素的工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效合成褪黑素的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

褪黑激素(melatonin)又称松果体素，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是由哺乳动物的松果体受到黑暗刺激后产生的一种胺类激素，能够改善动物机体睡眠质量。随着动物年龄的增长，褪黑素的分泌量逐渐下降，从而影响动物的睡眠质量。现在越来越多的研究表明褪黑素除了能够治疗失眠症外，还具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗癌等多种生理功能。最初认为褪黑素只存在于动物体内，20世纪90年代开始，科学家陆续在很多中药、发酵食品中发现褪黑素，说明褪黑素在植物、微生物细胞中也是普遍存在的，并且初步确定了其主要作用包括促进植物生长、侧根形成以及提高微生物细胞的环境耐受性。

目前，褪黑素的获得主要有生物提取和化学合成两大类。由于动植物中天然存在的褪黑素含量很少，并且提取原料来源有限，提取成本居高不下，工业应用受到诸多限制。化学合成是目前工业生产褪黑素中普遍采用的方法，经文献调研发现合成方法大致分为造环和借环合成两大类，需要用到污染且毒性较大的含苯环类物质和催化剂，并且产物分离提纯工艺复杂、耗能大、产物纯度低等问题。

采用微生物法合成褪黑素具有诸多优势，如反应条件温和、不涉及有毒有害的化学试剂；加之微生物生长周期短，能够实现高密度发酵，产物合成效率高。有研究者以酿酒酵母为宿主细胞，通过异源表达哺乳动物体内褪黑素合成相关的酶，重构了褪黑素合成路线，其合成褪黑素的产量为14.50mg/L，是目前文献报道的最大产量，但发酵耗时较长，需76小时发酵培养才达到最大产量。

发明内容

针对目前生物合成褪黑素产量低，耗时长的问题，本发明提供了一种高效合成褪黑素的基因工程菌，所述基因工程菌过表达色氨酸合成酶基因TRP5，敲除了吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

进一步地限定，所述色氨酸合成酶基因TRP5，GenBank ID为852858；所述吲哚胺2，3-双加氧酶基因BNA2，GenBank ID为853541。

进一步地限定，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。

本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，步骤如下：

1)PCR扩增获得TRP5基因，然后将TRP5基因连接到质粒pYES2-ADH中，构建携带TRP5基因的重组质粒pYES2-ADH-TRP；

2)整合型重组质粒pYES2-ADH-TRP-rDNA的构建：以酿酒酵母第XII染色体上重复序列为模板，设计引物扩增获得rDNA作为同源重组的同源臂，将所述rDNA连接到步骤1)获得的pYES2-ADH-TRP重组质粒中，构建整合型重组质粒pYES2-ADH-TRP-rDNA，转化到酿酒酵母中得到过表达TRP5基因的重组酵母；

3)吲哚胺2,3-双加氧酶基因BNA2的敲除：采用Cre/loxP重组酶系统构建BNA2基因敲除组件，然后将所述BNA2基因敲除组件转化到步骤2)获得的重组酵母中，得到BNA2基因缺失菌株，然后去除所述缺失菌株中的抗生素抗性基因得到BNA2单倍体缺陷型菌株。