[发明专利]新型冠状病毒更早期筛查方法

权利要求书

1.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2IgA抗体的试剂在制备用于作为早期筛选新型冠状病毒感染肺炎的检测试剂盒中的用途，检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白（简称S蛋白）RBD，该RBD蛋白截取的是SARS-CoV-2 S蛋白Gln321-Ser591位氨基酸序列；或者检测所述SARS-CoV-2IgA抗体的SARS-CoV-2重组抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白（简称N蛋白）片段，该蛋白片段截取的是SARS-CoV-2 N蛋白Met1-Ala419位氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒含有，

作为R1的SARS-CoV-2磁珠包被物：含包被SARS-CoV-2重组抗原的磁珠包被物三羟甲基氨基甲烷缓冲液，pH值为7.1-7.4；

作为R2的抗人IgA抗体吖啶酯标记物：为含有吖啶酯标记鼠抗人IgA单克隆抗体的2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2 S蛋白 RBD基因在C端通过一个TEV酶切位点序列连接人IgG1 Fc，然后将其克隆到哺乳动物表达载体pTT5并在翻译起始区加入了Kozak序列，然后转染到悬浮培养细胞HEK293F中，使用干扰素α-1作为信号肽使HEK293F细胞分泌RBD-TEV-Fc融合蛋白，再采用Protein A柱子和镍柱进行两次纯化；第一次纯化为采用Protein A柱子从培养基上清中获得RBD-TEV-Fc融合蛋白；第二次纯化为采用带有6His tag的TEV酶对融合蛋白进行酶切，将酶切产物依次流过Protein A柱子和镍柱，除去Fc、TEV酶以及第一次纯化时结合Protein A柱子的杂蛋白，最终在流穿中获得纯净的RBD蛋白；或者

SARS-CoV-2重组抗原的蛋白表达过程是：将SARS-CoV-2 N蛋白的基因在N端连接6Histag并克隆到原核表达载体pET28a中，再转化到大肠杆菌细胞BL21中进行蛋白表达，然后取破碎细菌在细菌裂解液中加入0.5-2.0 M 氯化钠，降低蛋白与核酸非特异性结合，再将裂解液过镍柱，洗脱后加入终浓度为0.25-1.0 M的硫酸铵室温搅拌10-20 min，使得蛋白暴露其疏水核心，再采用疏水柱进一步纯化蛋白，然后采用superdex-200分子筛除去多聚体及其它杂蛋白，最终获得高纯度构象统一的N蛋白片段。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液内含0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）；

2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液含有0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还含有：

作为R3的反应缓冲液：含羊抗人IgG抗体的磷酸盐缓冲液，内含0.05-0.2%吐温20（v/v）、2-8%牛血清白蛋白（w/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）；

SARS-CoV-2 IgA阴性对照：为SARS-CoV-2 IgA阴性血清；

SARS-CoV-2 IgA阳性对照：为人源性纯化SARS-CoV-2 IgM抗体；

阴阳性对照信息卡：含有阴阳性对照的发光值，用于筛选时的校正。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述试剂盒含有测试卡，测试卡由SARS-CoV-2 IgA测试条和塑料盒组成；

测试条含有硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫、吸水纸和PVC板支持物组成；

硝酸纤维素膜包被有抗人-IgA抗体，结合垫含有胶体金标记的SARS-CoV-2抗原。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还含有作为样本稀释液的Tris盐酸缓冲液，Tris盐酸缓冲液的pH值为7.1—7.4，内含0.5-2％的牛血清白蛋白（w/v）、0.05-0.2%吐温20（v/v）、0.25-1% Proclin300（v/v）。