[发明专利]一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法

权利要求书

1.一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器，其特征在于，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、参比电极和辅助电极；其中，所述参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂电极；

所述工作电极按如下方法制备：

（1）金电极预处理：

将d=2mm的金电极放入新配制的piranha溶液中浸泡10min，所述piranha溶液是由浓H₂SO₄和质量比30%的双氧水按体积比3:1配制而成；取出电极用超纯水冲洗3次，洗耳球吹干，在抛光布上，先后用直径为0.3和0.05 μm的氧化铝粉将电极抛光至镜面后，取适量双蒸水，清洗电极表面污物，再依次用超纯水、无水乙醇和超纯水进行超声洗涤，每次3min，在0.5mol/L的硫酸中，-0.2-1.5V范围内对电极进行扫描，共循环扫描二十圈，然后用超纯水淋洗，洗耳球吹干待用；

（2）混合自组装膜的构建：

将预处理过的金电极放入 8mmol/L MUA与8mmol/L ME按体积比8:2混合的混合溶液中，室温条件下进行组装24h，在金电极表面形成混合自组装膜，标记为MUA/ME/Au，最后电化学阻抗进行表征；

（3）电极表面羧基活化：

将MUA/ME/Au取出，进行清洗，并置入10mL EDC/NHS的混合溶液中进行电极表面羧基活化，所述混合溶液中含有0.1 mol/L的EDC和0.02 mol/L的NHS；PBS清洗，洗耳球吹干；

（4）修饰抗体：

滴加 20 μL 稀释2000倍的BmNPV多角体蛋白抗体于表面羧基活化处理后的电极上，并在4℃下组装过夜，将电极表面未结合或结合不牢固的抗体用双蒸水清洗并晾干；

（5）BSA封闭非特异性结合位点：

滴加20μL 1%的BSA溶液于修饰抗体后的电极上，在室温下放置1h，使得抗体上的非特异性结合位点被封闭，用PBS清洗电极表面，晾干；即制备得到工作电极。

2.权利要求1所述的电化学免疫传感器在制备检测家蚕核型多角体病毒的产品中的应用。

3.利用权利要求1所述的电化学免疫传感器检测家蚕核型多角体病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站在10mmol/L [Fe(CN)₆]^4/3- + 0.1 mol/L KCl的PBS溶液中，PBS溶液的pH 7.4；100mHz至100kHz的频率范围内以10mV的扰动幅度测定权利要求1的工作电极的阻抗值；

（2）将一系列不同浓度的BmNPV多角体蛋白抗原溶液滴加在权利要求1的工作电极表面，37℃孵育30min，PBS清洗后晾干，分别测定电化学阻抗谱，根据步骤（1）与步骤（2）中所测得的电化学阻抗值的变化绘制标准工作曲线；

（3）将待测样品滴加到权利要求1的工作电极表面，37℃孵育30min，测定电化学阻抗谱，根据所述标准工作曲线确定待测样品中病原的浓度。