[发明专利]一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器及其检测方法。本发明以十一巯基十一烷酸/β‑巯基乙醇混合自组装膜修饰金电极，用于固载BmNPV多角体蛋白抗体，利用抗原和抗体的特异性结合，完成对BmNPV多角体蛋白的捕获，基于混合自组装膜的电催化作用实现家蚕核型多角体病毒的超灵敏检测。本检测方法具有简便快速、特异性好、灵敏度高的特点，线性范围为0.0001‑100ng/mL，检出限为14.54fg/mL，适宜于家蚕核型多角体病的早期快速诊断和预防。

技术领域

本发明涉及一种电化学免疫传感器，特别是涉及一种基于混合自组装膜的电化学免疫传感器，属于病毒疫病诊断技术领域。

背景技术

家蚕核型多角体病毒属于杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状病毒属(Baculovirus)、蚕核型多角体病毒种(Bombyx moriNuclear Polyhedrosis Virus)，简称BmNPV，因侵入寄生在蚕血球、脂肪真皮、气管等细胞核，形成病毒多角体而得名。其多角体是一种内部包被有长杆状病毒粒子的蛋白质结晶，大小一般在2-6μm之间，平均3.2μm，可在光学显微镜下观察。多角体蛋白Polh作为多角体结晶基质的主要蛋白，是一种杆状病毒的高效表达蛋白质，感染后期在细胞中的累积可高达30％～50％。由BmNPV引起的家蚕核型多角体病是蚕业生产中危害最为严重的病害，该病传染性极强，难以控制。每年全国蚕桑生产因蚕病的损失占到总产量的30％，其中70％是由核型多角体病毒引起的。目前尚无有效的治疗方法，在感染发生初期及早检测出感染病原的个体，及时采取有效的防控措施，防止二次感染，是防止群体内蚕病大流行或避免蚕病爆发造成经济损失的有效途径。

目前，家蚕核型多角体病的检测方法主要包括症状观察、显微镜检、血清学方法和分子生物学技术。常规的症状观察、显微镜检和血清学方法主要依靠经验，对病毒的需要量大，检测周期长，难以对病毒潜伏期及早期病毒感染进行诊断，无法达到对蚕病早发现、早预防和及时切断病原传播以及二次感染途径的目的。分子生物学诊断技术虽然具有较高的特异性和灵敏性，但对检测设备和操作人员的要求较高，操作繁琐，检测成本相对较高，不适于在生产中推广应用。因此急需研究建立一种快速、特异、简便的高灵敏BmNPV检测技术。

电化学免疫传感器是一种结合免疫分析和电化学传感技术的新型生物传感器，具有特异性好，灵敏度高，检测时间短，可追踪和痕量检测免疫原等优点，近年来被广泛应用于临床医学与生物监测、食品工业、环境监测与处理等领域。

发明内容

针对上述现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器。本发明的电化学免疫传感器可以实现对家蚕核型多角体病毒的快速、灵敏和特异性检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测家蚕核型多角体病毒的电化学免疫传感器，包括：工作电极、参比电极和辅助电极；

所述工作电极按如下方法制备：

(1)将预处理后的金电极浸入十一巯基十一烷酸/β-巯基乙醇混合溶液中，在金电极表面形成混合自组装膜，得到MUA/ME/Au；

(2)将所述MUA/ME/Au浸入EDC-NHS混合溶液中反应，得到表面羧基活化的MUA/ME/Au；

(3)将所述表面羧基活化的MUA/ME/Au与BmNPV多角体蛋白抗体结合，得到抗体修饰的MUA/ME/Au；

(4)将所述抗体修饰的MUA/ME/Au用BSA封闭非特异性活性位点，即制备得到工作电极。