[发明专利]一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法

说明书

本发明公开了一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，属于医学检验技术领域。一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的质粒，所述质粒以大肠杆菌为载体，转化了该质粒的克隆菌株的保藏编号为CGMCC No.19437。本发明的优点如下：本发明建立了一种可靠的HTLV‑1荧光定量qPCR方法，该方法操作简单，成本较低，特异性好，重复性高，精密度、正确度和线性范围均可满足临床检测需求，灵敏度高，对HTLV‑1的最低检出线为3copies/μL，可相对定量HTLV‑1感染者的前病毒载量，为感染者的预后提供可靠实验数据。

技术领域

本发明涉及一种定量检测人类嗜T淋巴细胞病毒前病毒的方法，具体涉及一种TaqMan实时荧光定量PCR技术检测HTLV-1前病毒的质粒和检测方法，属于医学检验技术领域。

背景技术

HTLV的检测可分为筛查试验和确认试验两大类。酶联免疫吸附试验(ELISA)和明胶颗粒凝集试验(PA)是目前应用最为广泛的两项筛查方法。PA通常以培养的人T细胞系中的病毒裂解物作为抗原，而ELISA以重组或合成的多肽作为抗原，对血清中的抗体进行检测。这两种方法的灵敏度高、费检测成本低，适合大规模的献血者筛查。但由于特异度不足，因此，对于初筛反应阳性的样本，均需要用确认试验进行确证。

确认试验主要包括蛋白印迹试验(WB)、间接免疫荧光试验(IFA)、放射免疫沉淀试验(RIPA)和PCR法等，尤以WB最为常用。但该方法存在操作复杂、检测耗时长、灵敏度不高等缺点，在实际中很难大规模应用，而且检测存在大量不确定结果，很难判断献血者的真实感染状态，在实际中很难大规模应用；而常规PCR技术只能终点定量，无法对病原菌初始浓度进行准确定量。因此，为了更早期、直接地检测HTLV病毒感染，保证血液安全，迫切需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的检测HTLV的实时荧光定量 PCR方法。

人类嗜T淋巴细胞病毒(human T-cell lymphotropic virus，HTLV)是首个被发现与癌症相关的RNA逆转录病毒。到目前为止，共分离出四种HTLV亚型：HTLV-1-4。全世界大约有500-1000万人感染HTLV-1。感染HTLV-1的人群可发展成为成年人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)、相关性脊髓病和/或热带痉挛性瘫痪 (HTLV-1associated myelopathy/tropical spastic paraparesis，HAM/TSP)等相关疾病。中国属于HTLV低流行区，但在中国福建、广东等沿海地区发现有局部集中的 HTLV-1小流行。蛋白免疫印迹是目前应用最为广泛的一种确认方法，但往往出现大量不确定和不能分型的结果，该方法更不能对检测样本进行定量。而HTLV-1前病毒载量(PVL) 已被证实是相关疾病发生或进展的重要风险因子，因此急需建立一种可以定量检测 HTLV-1前病毒载量的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了解决现有检测HTLV-1方法中不能准确定量病毒拷贝数，且费时、费力的问题，本方案提供了一种可定量检测整合入人类基因组中的HTLV-1前病毒DNA的实时荧光定量PCR方法，以及该方法使用到的质粒标准品和试剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明针对内参基因RPPH1和目的基因HTLV Pol这两个区域设计特定的引物和探针，并将将这两个基因片段构建于同一质粒，制作质粒标准品。以梯度稀释的质粒标准品为模板，进行实时荧光定量qPCR构建标准曲线，同时提取待检血样本中的基因组DNA，并以之为模板进行qPCR，通过标准曲线从而对样本中的病毒拷贝数进行相对定量。

本发明的第一方面，提供一种检测HTLV-1的质粒标准品。