[发明专利]一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法

权利要求书

1.高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于，在用亚硝基胍(NTG)诱变链霉菌获得高产他克莫司菌株的条件下，分别以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，再将两者共同作为选择压。

2.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的通过亚硝基胍(NTG)在诱变体系中的浓度为0.9mg/mL亚硝基胍，处理25min。

3.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的活性物质韧革菌素的浓度为6mg·L^-1～30mg·L^-1。

4.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于：所述的乙基丙二酰辅酶A的浓度为6mg·L^-1～30mg·L^-1。

5.如权利要求1所述的高产他克莫司的链霉菌株诱变制备，其特征在于：所述活性物韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压的比例为1：3～3：1。

6.如权利要求1所述高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，其特征在于，所述诱变链霉菌和发酵培养的方法如下：

S1:斜面和分离琼脂培养基：在容器中加入麦芽浸出汁2％，酵母浸出汁0.5％，葡萄糖1％和琼脂1.5％混合，在灭菌前调节pH值为7.2；

S2:种子培养基:容器中加入甘油1.2％，可溶性淀粉1.1％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.5％，玉米浆0.5％和碳酸钙0.1％，在灭菌前调节pH值为7；

S3:发酵培养基:容器中加入糊精4％，可溶性淀粉2％，干酵母粉1％，玉米浆1％，赖氨酸0.1％，磷酸氢二钾0.2％和碳酸钙0.05％混合，油酸甲酯0.01％，丙酸钠0.1％，灭菌前调节pH值为7；

S4:不同选择压的母液配制:韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A分别用生理盐水配成6mg/mL～12mg/mL的母液，然后用0.8mol/L氢氧化钠溶液把母液调中性,接着将中性母液进行无菌过滤，保存在6℃条件下备用；

S5:琼脂平板的制备:S4中的韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A母液分别用二倍稀释法进行稀释,加入熔化并冷却至60℃的S1制备的分离培养基中,充分混匀,制成琼脂平板。

S6:斜面培养基上的筑波链霉菌孢子用生理盐水洗并制成孢子悬液，采用0.9mg/mLNTG处理25min，用生理盐水进行系列稀释的稀释液涂布在S5制备的琼脂平板上，30℃培养8天，挑选发酵筛选后存活的高产菌株；

S7:将S6中挑选到的高产菌株的斜面孢子培养物洗下并制成10⁶/mL的孢子悬液,，取适量稀释后的孢子悬液分别涂布含一定剂量韧革菌素或乙基丙二酰辅酶A溶液的分离琼脂平板上，在琼脂平板上，30℃培养8天；

S8：将S7中的斜面孢子用8mL的10％灭菌甘油水洗并制成悬浮液，在装有100mL种子培养基(500mL三角瓶)中接种0.2mL悬液，30℃、260r/min振荡培养3天；装有100mL发酵培养基(500mL三角瓶)用20％的种子量接入，30℃、260r/min振荡培养8天，获得含他克莫司的培养液。