[发明专利]一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法

说明书

提供一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法，本发明先用亚硝基胍(NTG)诱变育种，再以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，以达到他克莫司产量增加目的；本发明以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的他克莫司产量比单一选择压的诱变育种产量明显高。以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A协同作为选择压制备的筑波链霉菌具有烯丙基丙二酰辅酶A活性高和脂肪酶活性高的特性，这两者活性高能提高他克莫司产量，减少副产物生成，两者共同使用比单一选择压的诱变育种产量明显高。

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体为一种高产他克莫司的链霉菌株诱变制备方法。

【背景技术】

他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是1979年从日本筑波地区土壤中一种链霉菌株发酵产物中分离出来的23环大环内酯类抗生素(红霉素族)，用于肝脏和肾脏移植后的免疫排斥，可由多种链霉菌产生。其免疫抑制疗效是环孢素A的10～100倍，但不良反应更小。其作用机制与环孢菌素相似，通过抑制钙调磷酸酶活性以减少由白介素-2产生的T-细胞介导的免疫反应，但其作用效果比环孢菌素强10～100倍。近年，FK506在免疫抑制剂市场的销售额已经占据全球20％以上。除此之外还用于特异性皮炎等自身免疫性疾病，保护神经以及神经再生等方面的治疗。他克莫司的化学合成效率低、成本高，因此考虑采用微生物发酵法制备。

FK506生物合成开始于4,5-二羟基-1-烯基环己烷羧酸(DHCHC)，经过10个聚酮链延伸循环，随后由哌可酸闭合23元环，内酯环进一步羟基甲基化。

由于他克莫司的重要医用价值，很多人尝试着用培养基优化的方法提高他克莫司的产量。Singh等研究了外源添加花生油、大豆油、棉籽油和氨基酸对于菌种Streptomycesspp.MA6858 B3178合成他克莫司的影响，外源添加30g/L大豆油和0.2g/L的赖氨酸，发酵5d时产量由85.8mg/L提高到103.1mg/L(Singh B P，Behera B K.Regulation of tacrolimusproduction by altering primary source of carbons and amino acids[J].Lettersin Applied Microbiology，2009，49(2):254－259)。Jung等通过逐渐提高培养基中他克莫司的浓度(600～1 600mg/L)来增加菌株对产物的耐受性，最终获得的菌株产量达到972mg/L(Jung S，Moon S，Lee K，et al.Strain development of Streptomyces sp.fortacrolimus production using sequential adaptation[J].Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology，2009，36(12):1 467－1 471)。

目前，国内研究他克莫司主要围绕自然筛选，原始菌株诱变筛选，优化发酵培养基和发酵操作条件等。李玲等采用抑菌圈法初筛得到71株能抑制白色假丝酵母生长的菌株，高效液相色谱法检测代谢产物复筛，获得一株他克莫司产生菌株(李玲，陈林，杨文革，等.一株他克莫司产生菌的筛选及鉴定[J].食品与生物技术学报，2010，29(3):416－420)。

在某一特定酶催化的代谢物过程中，如果存在酶抑制剂，那么酶活性低的或者受酶抑制剂影响不能产他克莫司的微生物会出现低产或者不产产物的现象，只有那些酶活性高的微生物不受影响。筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)在合成他克莫司过程中，还伴随着副产物子囊霉素的产生。他克莫司插入的烯丙基丙二酰辅酶A被乙基丙二酰辅酶A替换时生成产物为子囊霉素，提高烯丙基丙二酰辅酶A的活性能够增加目标产物产量。

【发明内容】

本发明针对现有技术的不足，提供一种生物诱变育种方法提高他克莫司的产量。本发明先用亚硝基胍(NTG)诱变育种，再以活性物质韧革菌素和乙基丙二酰辅酶A作为选择压，以达到他克莫司产量增加目的。