[发明专利]一种提高手性胺转化率的方法

权利要求书

1.一种提高手性胺转化率的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于节杆菌属的(R)-选择型ω转氨酶的氨基酸序列，所述(R)-选择型ω转氨酶简称：ArR-ωTA；所述ArR-ωTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ArR-ωTA的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的ArR-ωTA核苷酸序列；

在优化后的ArR-ωTA核苷酸序列前、后分别加入XbaI限制性酶切位点和HindIII限制性酶切位点，得到含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列，所述含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)获得的含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-ArR-ωTA；将表达甲酸乙酰转移酶的核苷酸序列用FA表示，将FA连接到p2A4载体中，得到p2A4-FA；将ldh的核苷酸序列连接到p2A4载体中，得到p2A4-ldh；

所述p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-FA；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌中，得到重组菌1，重组菌FA和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌FA和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌FA发酵液和重组菌6发酵液；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，离心收集沉淀，洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀用PBS重悬细胞并进行超声破碎处理；得到FA粗酶液和ldh粗酶液；

(7)将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用PBS重悬，得混合液，取混合液加入PLP、NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脱氢酶、D-丙氨酸、底物酮和CoA，得到反应液，加入助溶剂，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

2.根据权利要求1所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述FA为ybiw、pflB、pflD或tdcE，所述ybiw的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，pflB的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，pflD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，tdcE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述步骤(7)为：将步骤(5)获得的重组菌1发酵液沉淀用pH＝7.5浓度为100mM的PBS重悬，得混合液，所述PBS的体积为步骤(4)获得的重组菌1发酵液体积的1/7,按比例，取1mL混合液，加入终浓度为1.5mM的PLP、终浓度为1mM的NAD⁺，在25℃-40℃，180-220rpm下反应20-40分钟；再加入10U的FA粗酶液、10U的ldh粗酶液、10U的甲酸脱氢酶、终浓度250mM的D-丙氨酸、终浓度25mM底物酮和终浓度0.1mM的CoA，得到反应液，加入反应液体积15％-60％的助溶剂DMSO，在25℃-40℃，180-220rpm下反应12-24小时，加入终浓度10M的NADH终止反应，并用乙酸乙酯萃取，萃取两次，萃取后的有机相加入Na₂SO₄干燥，干燥后用气相色谱检测。

4.根据权利要求1或3所述的一种提高手性胺转化率的方法，其特征是所述酮为2-戊酮、环己酮或苄基丙酮。