[发明专利]一种提高手性胺转化率的方法

说明书

本发明公开了一种提高手性胺转化率的方法，包括：合成和扩增含酶切位点的优化后的ArR‑ωTA核苷酸序列，构建p2A4‑ArR‑ωTA、p2A4‑FA和p2A4‑ldh，FA为表达甲酸乙酰转移酶的基因，分别导入大肠杆菌，得到重组菌1、FA和6；发酵，得到重组菌1、FA和6发酵液；离心，得到重组菌1、FA和6发酵液沉淀；分别制成FA粗酶液和ldh粗酶液；将重组菌1发酵液沉淀用PBS重悬，加PLP、NAD⁺，反应；再加FA粗酶液、ldh粗酶液、甲酸脱氢酶、D‑丙氨酸、底物酮和CoA，加助溶剂，反应，终止，萃取，干燥。本发明的方法去除副产物丙酮酸，提高手性胺的转化率。加甲酸脱氢酶回收辅因子还原型辅酶Ⅰ。

技术领域

本发明属于化学领域，特别是涉及一种提高手性胺转化率的方法。

背景技术

近年来，对映体纯胺在化学、制药和农用化学工业中起着至关重要的作用。手性胺被广泛用于治疗药物，例如神经科药物，心血管药物，降压药，抗感染药和疫苗。目前，化学法、生物拆分法和生物不对称合成法是制备手性胺的主要方法。不对称合成法因其对环境的污染小，理论收率可达100％而成为研究的热点。在利用转氨酶不对称合成手性胺过程中，转氨反应为可逆反应并且副产物丙酮酸会阻碍反应往产生胺的方向进行。目前主要利用乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶偶联体系消除副产物丙酮酸的抑制作用并且使辅因子再生，从而提高手性胺的转化率。在利用转氨酶不对称合成手性胺的反应中，还没有人通过甲酸乙酰转移酶和乳酸脱氢酶偶联体系来提高手性胺的转化率报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高手性胺转化率的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种提高手性胺转化率的方法，包括如下步骤：

(1)基因的体外合成和扩增：

从NCBI数据库获得来源于节杆菌属的(R)-选择型ω转氨酶的氨基酸序列，所述(R)-选择型ω转氨酶简称：ArR-ωTA；所述ArR-ωTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述ArR-ωTA的氨基酸序列在JCAT网站，通过输入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位点为条件，得到优化后的ArR-ωTA核苷酸序列；

在优化后的ArR-ωTA核苷酸序列前、后分别加入XbaI限制性酶切位点和HindIII限制性酶切位点，得到含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列，所述含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)获得的含酶切位点的优化后的ArR-ωTA核苷酸序列连接到p2A4载体中得到p2A4-ArR-ωTA；将表达甲酸乙酰转移酶的核苷酸序列用FA表示，将FA连接到p2A4载体中，得到p2A4-FA；将ldh的核苷酸序列连接到p2A4载体中，得到p2A4-ldh；

所述p2A4载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

(3)将p2A4-ArR-ωTA；p2A4-FA；p2A4-ldh分别导入大肠杆菌(E.coli MG1655)中，得到重组菌1，重组菌FA和重组菌6；

(4)将重组菌1、重组菌FA和重组菌6分别发酵，得到重组菌1发酵液、重组菌FA发酵液和重组菌6发酵液；

(5)分别将步骤(4)获得的发酵液，离心收集沉淀，洗涤，得到重组菌1发酵液沉淀、重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀；

(6)分别将步骤(5)获得的重组菌FA发酵液沉淀和重组菌6发酵液沉淀分别用PBS重悬细胞并进行超声破碎处理；得到FA粗酶液和ldh粗酶液；