[发明专利]细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用。本发明获得的CYP基因GL20421可催化灵芝酸HLDOA形成一种新的天然灵芝三萜产物‑式(I)所示的灵芝三萜类化合物；本发明获得的CYP基因GL21117可催化灵芝酸HLDOA形成的灵芝酸Jb，其与天然的化合物结构完全一致，具有同等的产品性能和质量。本发明通过将GL20421和GL21117基因在酿酒酵母中异源表达，实现了灵芝三萜类化合物异源生物合成，产率高，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用。

背景技术

三萜类化合物由六个异戊二烯单元聚合而成，在自然界中分布广泛、种类众多，主要以游离、苷或酯的形式广泛存在于蕨类、真菌类、单子叶和双子叶植物中，少数存在于动物体内(Vincken,J.P.,et al.,Phytochemistry,2007.68(3):p.275-97)。研究表明，三萜类化合物具有降血糖、抗炎、降血脂等多种生物活性(郑光海等,华西药学杂志,2011.26(03):294-297)，是抗糖尿病药物研究的重要先导化合物(诸夔妞等，中国药科大学学报，2015，46(6)：764-770)，在抗肿瘤方面具有“靶向杀伤”的特性，对乳腺癌、肺癌、直肠癌和中枢神经癌等多种肿瘤均具有显著的抑制效果(Kim,E.H.,et al.,Cancer Prev Res(Phila),2011.4(3):425-34；Zhang,Y.,et al.,Food Chem,2013.138(1):208-13；Yu,L.,et al.,Bioorg Med Chem Lett,2012.22(16):5232-8；Lanzotti,V.,et al.,Bioorg MedChem,2012.20(10):3280-6；Shanmugam,M.K.,et al.,BiochemPharmacol,2013.85(11):1579-87)，成为近年来国内外抗肿瘤药物研究的焦点之一(Shanmugam,M.K.,et al.,Biochem Pharmacol,2013.85(11):1579-87；Szakiel,A.,et al.,J Agric Food Chem,2012.60(19):4994-5002；Pena-Rodriguez,L.M.,et al.,J Org Chem,2014.79(7):2864-73)。

研究表明，三萜类化合物具有几大类不同的骨架结构，各化合物间的差异取决于骨架形成后的后修饰过程，其中细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)发挥主要作用，是三萜类化合物生物合成途径研究的重点。目前对三萜类化合物生物合成的研究主要集中在植物方面。

灵芝中含有丰富的三萜类化合物。从1982年(Kubota,T.,et al.,HelveticaChimica Acta,1982.65:611-619)起，目前人们已成功分离鉴定出200多种灵芝三萜类化合物(Baby,S.,et al.,Phytochemistry,2015.114:66-101)。灵芝在辅助肿瘤治疗、抗HIV、提高人体免疫力、延缓衰老等方面具有显著效果(Sliva,D.,Mini Rev Med Chem,2004.4(8):873-9)。灵芝这些独特的功效得源于其胞内一系列具有生理活性的次级代谢产物。其中，灵芝三萜类化合物尤为重要(Qin,H.,et al.,Bioreactor Engineering Research andIndustrial Applications I:Cell Factories,2016.199-235)，引起人们的广泛关注(Tang,W.,et al.,Life Sci,2006.80(3):205-211；Zhao,Y.,et al.,Bioresour Technol,2018.257:339-343；Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311)。

然而，灵芝的生长周期过长且易受环境因素影响，灵芝三萜类化合物产量过低，产物提取、分离纯化程序繁琐，成本较高，都严重限制了灵芝三萜的开发和利用。