[发明专利]一种特异性扩增RNA的引物、其设计方法及用途

说明书

本发明提供了一种反转录引物，其由RNA模板互补部分和人为引入的错配部分组成。在具体实施方案中，所述反转录引物的序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10、和/或SEQ ID NO：14。本发明还提供了设计所述反转录引物的方法。通过在RT‑PCR中使用这种引物，可以特异性扩增RNA，而不会扩增相同序列的DNA。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种反转录引物及其设计方法。通过在RT-PCR中使用这种引物，可以特异性扩增RNA，而不会扩增相同序列的DNA。

背景技术

在转录过程中，以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对为原则，形成一条RNA单链，其主要功能是实现遗传信息在蛋白质层面的表达，是遗传信息向表型转化过程的重要桥梁，所以RNA检测对于基因表达与功能分析具有十分重要的意义。但是，由于RNA的形成机制，转录得到的RNA的序列必然会与DNA的某一条链完全相同(原核生物)或部分完全相同(真核生物)。因此在DNA和RNA同时存在的核酸样品中，以反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增为基础的RNA检测手段可以同时扩增相同序列的DNA模板，最终的扩增后产物既可能来自于RNA模板，也可能来自于DNA模板，这样难以对样品中的RNA进行准确的定性或定量检测，该现象在检测原核生物RNA或不跨越内含子的真核生物RNA时会难以避免。

为消除DNA模板对RNA检测的干扰，在常规检测中多是采用脱氧核糖核酸酶(DNaseI)对核酸样品进行消化以去除DNA，并辅以琼脂糖凝胶电泳进行DNA条带检测(原核生物)，或采用跨内含子-外显子引物对核酸酶消化后的模板进行PCR扩增(真核生物)，以确保无DNA干扰。由于DNA消化过程需要一定的时间(10-20分钟)和温度(37℃)，即便是在无核糖核酸酶存在的溶液中，DNA消化过程也很难保证RNA的完整性，这也会在一定程度上影响RNA检测的准确性。因此，一种不需要进行DNA消化步骤，可以选择性扩增RNA模板的一步法反转录PCR对于RNA和DNA共存环境下的RNA检测具有十分重要的意义。

发明内容

本发明设计并提供了一种反转录引物，在该引物的5’端人为引入一定数量的错配碱基。在反转录过程中利用该引物以RNA为模板进行cDNA第一链的合成。由于反转录温度较低，5’端的错配不会影响反转录引物对模板的识别与延伸，使得cDNA的5’端出现与DNA完全不同的碱基序列，在进入第一轮PCR扩增时，由正向引物引导合成cDNA互补链，形成包含人为引入的错配部分的双链DNA。当这种DNA与基因组DNA共同存在于PCR环境中时，反转录引物在一定的退火温度条件下只能退火结合与自身完全匹配的模板链，即包含人为引入的错配部分的DNA模板，而不能与原始基因组DNA模板进行正常的退火结合。对于原始基因组DNA模板，即便存在与自身DNA模板完全匹配的上游引物，也只能发生线性扩增。如此也就实现了通过引物设计在一步法反转录PCR中区分DNA和RNA模板的目的，在保证RNA检测结果准确性的前提下，去除了DNA消化过程，降低了检测试剂成本，加快了实验流程(如图1所示)。

第一方面，本发明提供了一种以RNA为模板的反转录引物，其由RNA模板互补部分和人为引入的错配部分组成。

第二方面，本发明提供了一种设计并获得第一方面的反转录引物的方法，包括以下步骤：设计引物，使其由RNA模板互补部分和人为引入的错配部分组成。

第三方面，本发明提供了第一方面的反转录引物用于区分DNA模板和RNA模板，实现RNA特异性扩增的用途，所述DNA模板和RNA模板存在于同一样品中或不同样品中。

第四方面，本发明提供了一种在同时存在DNA和RNA的样品中特异性扩增RNA的方法，包括使用第一方面的反转录引物进行RT-PCR。

第五方面，本发明提供了一种RT-PCR试剂盒，其包含第一方面的反转录引物。

附图说明

图1为使用本发明的反转录引物，进行RT-PCR的原理示意图。