[发明专利]一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法

权利要求书

1.一种测定鸡肉中喹诺酮类兽药残留的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL1.0mg/mL的8种喹诺酮类药物诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、氧氟沙星、马坡沙星、沙氟沙星和奥比沙星储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1 mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1 mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；

2）样品溶液的制备：取待测鸡肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入乙腈20mL，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；

3）线性溶液的制备：称取不含喹诺酮类药物的鸡肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入20 mL乙腈溶液，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL复合溶剂复溶，过滤后制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各喹诺酮药物浓度分别为4ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；

4）空白溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入20mL乙腈溶剂，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；

5）加标回收试验样品溶液的制备：取不含喹诺酮类药物的鸡肉样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为3 ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为10 ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入20mL复合溶剂，高速匀浆1-3 min，于4000-5000 r/min离心4-6 min，取15-20mL上清液氮气吹干，残渣用0.75-1mL 10%甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；

6）用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液

a进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内，

色谱和质谱条件

1）一维液相色谱条件

色谱柱：凝胶柱 4.6×150 mm，5 μm，150 Å；流动相为pH=7.4的磷酸盐缓冲液；流速为0.35 mL/min；富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10 μm；

2 ）二维液相条件色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1×50 mm，1.7 μm；流动相A相为0.1 %甲酸水，流动相B相为0.1 %甲酸甲醇；梯度洗脱；柱温为35 ℃；进样量为5 μL，梯度洗脱条件如下表所示：

；

3） 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，正离子模式，ESI+；毛细管电压为3.0 kV；离子源温度为150℃；脱溶剂气为N2；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流速为800 L/h；锥孔流速为150 L/h；碰撞气为Ar；扫描方式为多反应监测；

b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算

以线性溶液中的目标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，

式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；

c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一喹诺酮类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该喹诺酮类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：

C=(A-b)/a

式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积；

a和b由步骤b计算得到；

d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60-120%，证明该方法可行。