[发明专利]CD90posi细胞CircRNA的差异性表达测试方法

说明书

本发明提供一种CD90posi细胞CircRNA的差异性表达测试方法，包括：通过对肝癌细胞中CD90posi亚群总RNA构建CircRNA文库，进行CircRNA的高通量测序或分离肝癌患者肿瘤组织CD90posi细胞总RNA，进行CircRNA高通量测序。根据测序情况，对结果进行生物信息学分析，采集差异表达的分子，进行基因GO、Pathway富集等生信分析，筛选出差异表达的候选CircRNA并做细胞学验证，对候选CircRNA在病人血清中的表达与CD90posi细胞群数量及肿瘤进展做相关性分析，评价CircRNA作为肿瘤检测血清标志物和治疗靶点的可行性。

技术领域

本发明涉及细胞差异性表达方法领域，尤其涉及一种CD90posi细胞CircRNA的差异性表达测试方法。

背景技术

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率较高，每年约有60万以上的患者死于肝癌，病死率位居国内肿瘤第二位，严重威胁人民群众的生命健康。肝癌起病隐匿，临床表现缺乏特别性，患者就医时往往处于肝癌中晚期，肝癌早期患者难以发现，严重影响肝癌的治疗效果。目前肝癌的临床检测手段主要通过检测患者血清甲胎蛋白(AFP)并结合影像学检查进行确诊，可分为以下几类：B超检查，B超受肠气及周围脏器的影响，分辨率较低；虽可在B超引导下进行肝脏占位病灶穿刺活检，但肝穿刺的病理诊断存在一定假阴性率；同时肝脏穿刺存在肝创面出血、肿瘤随针道转移等严重并发症，限制了其临床应用。CT与磁共振成像：CT或MR仅能分辨直径1.0cm以上的病灶，且仍有一定的假阳性率与假阴性率。DSA技术：虽可提高肝癌检测的准确率，但DSA为一种侵入性创伤性检查，多用于肝癌治疗，检测范围和实用性受到极大限制。

随着分子生物学技术进步，人类对疾病的认识从宏观到微观，从环境到基因，从遗传到表观遗传，逐步深入。越来越多的学者认为，肿瘤的发生是多因素协同作用的结果。以表观遗传为例，基因5’端启动子区DNA甲基化能影响启动子活性，而miRNA则从3’UTR区发挥调控功能，二者既能协同作用，也能相互制约，研究发现，约10％的miRNA表达受到DNA甲基化的影响；而circRNA可作为miRNA海绵或缓冲剂，通过吸附或释放miRNA来影响靶基因表达。

通过对肝细胞癌微环境细胞群的分析，筛选出CD90posi肿瘤细胞，发现CD90posi细胞促进肝癌细胞的增殖、迁移。同时，CD90posi细胞表现出很强的增殖潜力和细胞干性。将CD90posi肝癌细胞和肿瘤细胞系中其他侧群细胞按不同比例混合，并注射于裸鼠皮下，发现随着CD90posi细胞所占比例增加，移植的肿瘤体积和重量越大，表明CD90posi细胞是肝细胞癌增殖和生长的关键因素。

进一步，在CD90posi细胞中发现GLI1/3转录因子的高表达，并通过分子表达干预、分子抑制剂使用等实验手段，在培养的肝癌细胞和移植的裸鼠皮下干细胞癌中证明了GLI1/3促进CD90posi细胞的分化，并激活IL-6/STAT3信号通路，促进肿瘤细胞的增殖。并且，在大多数原发性肝癌患者中检测CD90的表达，并在随访研究中证明CD90高表达的肝癌患者预后较差。这与TCGA肝癌大数据的统计结果一致。

在肝癌细胞系Huh7和97L中分离出CD90posi肿瘤细胞，并对细胞进行CircRNA-Seq的工作，利用生物信息学的分析方法，筛选出差异表达的CircRNA分子，并根据序列相关性的原则分析了CircRNA母本基因的GO功能通路富集情况。结果显示，CircRNA在CD90posi肝癌细胞中的存在较显著的差异表达，这些差异表达的基因参与了肿瘤细胞的能量代谢、信号转导、蛋白泛素化降解和基因表达调控等重要过程，CircRNA或许可以作为原发性肝癌检测和筛查的分子指标。一方面CircRNA的变化反应了细胞代谢和信号转导的异常；另一方面，CircRNA可以表征CD90在肿瘤组织中的表达水平。