[发明专利]制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒

权利要求书

1.一种制备单细胞核悬液的方法，其特征在于，包括：

(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；

(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；

(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：

(3-1)基于所述裂解产物，采用碘化丙啶染液标记，以便获得标记产物；

(3-2)基于所述标记产物，采用流式细胞术分选获得细胞核，以便获得单细胞核悬液；

任选地，采用流式细胞术分选获得细胞核包括：

基于所述标记产物，选定细胞核所在的大范围；

基于所选定的细胞核所在的大范围，选定游离的、不黏连的颗粒；

基于所述染液的荧光信号选定细胞核，以便获得单细胞核悬液；

任选地，步骤(2)中所述表面活性剂包括选自吐温20、乙基苯基聚乙二醇、脱聚乙二醇辛基苯基醚、氧胆酸钠、肌氨酸钠中的至少一种；优选包括吐温20和乙基苯基聚乙二醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述第一溶液包括：

5～50mM盐酸盐缓冲液，

5～50mM氯化钠，

1～10mM氯化镁，

0.1体积％～0.5体积％的吐温-20，

0.2体积％～1体积％的乙基苯基聚乙二醇，

0.01质量％～0.05质量％的洋地黄皂苷，和

1质量％～5质量％的牛血清蛋白；

优选地，所述第一溶液包括：

10mM盐酸盐缓冲液，

10mM氯化钠，

3mM氯化镁，

0.1体积％的吐温-20，

0.5体积％的乙基苯基聚乙二醇，

0.01质量％的洋地黄皂苷，和

1质量％的牛血清蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：

(1-1)利用第二溶液对所述组织样本进行避光酶解处理，以便获得酶解产物，所述第二溶液包括甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液、牛血清蛋白、钙离子和消化酶；

(1-2)将所述酶解产物进行离心过滤，获得的沉淀采用第三溶液进行洗脱，以便得到原生质体，所述第三溶液包括钠离子、钙离子、钾离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液；

任选地，进一步包括：

(1-3)将采用第三溶液洗脱后的洗脱产物进行离心过滤，获得的沉淀加入第四溶液重悬，以便获得原生质体悬浮液，所述第四溶液包括甘露醇、镁离子和脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述消化酶包括选自纤维素酶、果胶酶、离析酶中的至少一种；

任选地，所述消化酶包括选自纤维素酶R-10、果胶酶Y-23、纤维素酶、离析酶中的至少一种；

任选地，所述组织样本为植物幼嫩组织或者动物组织样本。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包括：

0.3～1M甘露醇，

5～50mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，

0.5质量％～5质量％的牛血清蛋白，

1～5mM氯化钙；

任选地，所述第二溶液包括：

0.6M甘露醇，

10mM脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液，

1％牛血清蛋白，

1mM氯化钙；

任选地，所述第二溶液通过下述方法制备：

将甘露醇、脂肪酸甲酯磺酸盐缓冲液和消化酶混合溶解，在50～60摄氏度条件下加热；

冷却后与牛血清蛋白和氯化钙混合，以便获得所述第二溶液。