[发明专利]制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。所提供的制备单细胞核悬液的方法包括(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。所提供的单细胞测序方法包括利用上述方法制备的单细胞核悬液，进行单细胞测序。通过本发明的方法能够获得稳定的高活力的单细胞核悬液，使得细胞损伤小，可以直接用于单细胞测序实验。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。

背景技术

单细胞测序技术经过了10余年的发展，取得了众多进展与突破，成为人类疾病、物种进化、分子育种等传统的生物学研究领域的重要工具。单细胞测序实验前，需将生物组织消化、解离，从而制备单细胞悬液作为实验材料。制备单细胞悬液的目的，是快速从组织中分离出单个细胞，同时避免细胞死亡和聚集。动物组织制备单细胞悬浮液的基本步骤包括：1)破碎固体组织材料以增加其表面积，使组织和消化酶之间的接触最大化，2)引入消化酶来消化细胞外基质，3)切割细胞与细胞之间的连接。如需开展ATAC(染色质可及性测序)等研究，则需要制备高质量单细胞核悬液，目前也是主要针对动物样本开展。

而植物样本由于具有细胞壁，目前没有稳定成熟的技术，来制备单细胞悬液并开展单细胞测序实验。针对植物样本的单细胞核悬液的制备以及单细胞测序技术，还需要进一步改进。

发明内容

本发明至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法、单细胞测序方法及试剂盒。

针对植物组织来制备单细胞核悬液，用于单细胞测序主流方案是利用植物组织制备原生质体，然后利用操作繁琐的密度梯度离心的方法获得细胞核。但是通过这种方法所获得的单细胞核悬液，其质量差，步骤繁琐，效率低。为此，发明人通过对原生质体制备细胞核的工艺条件进行优化和改进，通过溶液对原生质体进行裂解处理，能够产生具有高活力的单细胞核悬液，使得细胞的损伤小，同时能保证细胞内的遗传物质不被降解，以用于单细胞测序实验。另外，在裂解之后分离获得单细胞核悬液时，借助于流式细胞术进行细胞核的分选，能够稳定获得高质量的单细胞核悬液，且适用场景广泛，不仅适用于植物组织的单细胞核悬液的制备，还适合于动物组织的单细胞核悬液的制备。

进一步地，在利用植物样本酶解制备原生质体的过程中，通过对酶解溶液进行改进和优化，能够保证酶解过程的高效，并获得高活力的原生质体，有利于后续获得高品质的单细胞核悬液。

具体而言，本发明提供了如下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种制备单细胞核悬液的方法，包括：(1)基于组织样本，进行酶解处理，分离获得原生质体；(2)将所述原生质体利用第一溶液进行裂解处理，以便获得裂解产物，所述第一溶液包括盐酸盐缓冲液、钠离子、镁离子、表面活性剂、洋地黄皂苷和牛血清蛋白；(3)基于所述裂解产物，分离获得单细胞核悬液。

本发明所提供的制备单细胞核悬液的方法，其在对原生质体裂解时，应用所提供的第一溶液进行裂解处理，能够获得完整的细胞核，从而减少样本损失，且适用于不同植物组织样本和动物组织样本的处理，例如拟南芥、水稻、玉米等等，适用样本来源范围广。所提供的方法尤其适用于植物幼嫩组织，能够产生具有高活力单细胞核悬液，细胞损伤小，同时保证细胞内的遗传物质不被降解，以用于单细胞测序实验。还适用于动物组织制备单细胞核悬液。

根据本发明的实施例，以上所述制备单细胞核悬液的方法可以进一步包括如下技术特征：

根据本发明的实施例，步骤(2)中所述表面活性剂包括选自吐温20、乙基苯基聚乙二醇、脱聚乙二醇辛基苯基醚、氧胆酸钠、肌氨酸钠中的至少一种，优选包括吐温20和乙基苯基聚乙二醇。