[发明专利]幽门螺旋杆菌分型与耐药检测的扩增和测序引物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序引物及其试剂盒。试剂盒内包括PCR扩增用的反应液A，包被引物对的反应管，以及测序用引物H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11。本发明可一次性在相同PCR反应条件下对幽门螺旋杆菌所有11个目的序列进行扩增，再用测序引物按设定程序进行测序。PCR反应体系中带荧光染料，可以直接通过荧光值的升高位置来判定扩增结果，避免电泳带来的不便和污染。引物直接包被在反应管中，避免使用引物时配置繁琐。该试剂盒可用于检测幽门螺旋杆菌毒力分型及耐药基因，本发明可用于对临床活检标本和石蜡包埋的标本进行检测，能为幽门螺旋杆菌治疗提供细菌的分型和耐药信息。

技术领域

本发明涉及基于聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术的分子生物学方法，尤其涉及一种用于幽门螺旋杆菌基因分型和耐药突变检测的扩增和测序引物及其试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是能够在人的胃中存活的唯一微生物种类，定植的幽门螺杆菌可引起慢性炎症、消化性溃疡甚至胃癌，统计数据表明国内有50-60％的人有Hp的感染。作为胃癌的最重要的致病因子之一，Hp在1994年被世界卫生组织将其定为I类致癌原。Robin warren和Barry Marshall也因为发现幽门螺杆菌和胃病的关系而获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。

Hp包括多种亚菌型，携带不同基因型的菌的毒性和导致的临床疾病不同，与毒素相关的基因有cagA、vacA、dupA、iceA、UreA等等，可用于分型并对临床治疗提供参考。数据表明，20％～30％的感染者没有发病但检测发现其终身携带Hp；50％以上Hp感染者引发慢性炎症，并且程度不等；10％～15％Hp感染者引发消化性溃疡；只有极少数的感染者出现了胃部恶性肿瘤，结果说明只有部分Hp引起疾病产生，而不同Hp亚型引起疾病的严重程度不同、结局状态不同。目前，还未开发出检测全面、结果准确的幽门螺旋杆菌基因突变测序检测试剂盒用于临床诊断。本发明基于聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术，通过设计、筛选得到一套理想的对幽门螺旋杆菌分型与耐药进行扩增和测序的引物，达到全面检测幽门螺旋杆菌基因是否发生突变的目的，进行准确的基因分型，为HP分型和耐药提供检测手段。

发明内容

本发明的目的是克服现有分子诊断技术中检测幽门螺旋杆菌突变类型多、检测不全面的缺陷，提供一套优化引物用于PCR扩增和测序，能在相同条件下一次性进行11个目的基因序列的扩增PCR，顺利扩增和测序幽门螺旋杆菌基因的分型和耐药相关区域。

本发明第二个目的是提供一种配套此引物进行幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的特定的PCR反应程序，达到快速扩增的目的。

本发明第三个目的是提供一种对临床标本进行幽门螺旋杆菌进行序列分析的荧光PCR扩增试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

用于幽门螺旋杆菌分型与耐药突变检测的扩增和测序引物，包括UreA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，16S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4，rdxA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，23S rRNA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8，gyrA的扩增和测序引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，PBP1的扩增和测序引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，cagA的扩增和测序引物为SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14，vacAs的扩增和测序引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16，vacAm的扩增和测序引物为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，vacAi的扩增和测序引物为SEQ IDNO.19和SEQ ID NO.20，vacAii的扩增和测序引物为SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。