[发明专利]人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒

权利要求书

1.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的引物，其特征在于，所述引物为：

以SEQ ID NO.1所示序列为上游引物Pri-F1的核苷酸序列；

以SEQ ID NO.2所示序列为下游引物Pri-R1的核苷酸序列。

2.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的探针，其特征在于，所述探针包括针对人BRAF基因V600E位点的野生型探针和突变型探针；

以SEQ ID NO.3所示序列为野生型探针的核苷酸序列；

以SEQ ID NO.4所示序列为突变型探针的核苷酸序列。

3.使用权利要求1所述引物或权利要求2所述探针用于配制一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri-F1、下游引物Pri-R1、野生型探针和突变型探针。

4.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述突变型探针和所述野生型探针的5’端标记不同的荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团。

5.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述上游引物Pri-F1和下游引物Pri-R1的浓度为500～1000nM。

6.根据权利要求3所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液，其特征在于，所述突变型探针和野生型探针的浓度为100～500nM。

7.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3～6任一项所述的PCR反应液。

8.一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒应用方法，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：

1)提取DNA模板，浓度为10～50ng/μl；

2)配制PCR反应液：PCR预混液、20μM上游引物、20μM下游引物、10μM突变型探针、10μM野生型探针、ddH₂O；

3)配制PCR特异扩增反应体系；

4)将PCR特异扩增反应体系生成微滴；

5)进行数字PCR扩增，并通过软件计算突变率。

9.根据权利要求8所述的一种人BRAF基因V600E位点突变检测的试剂盒应用方法，其特征在于，所述步骤2)中，配制PCR反应液的份量包括：PCR预混液10μl，20μM上游引物1.8μl，20μM下游引物1.8μl，10μM突变型探针0.5μl，10μM野生型探针0.5μl，ddH₂O 3.4μl。