[发明专利]人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒

说明书

本发明涉及一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液，PCR反应液包括PCR反应预混液、上游引物Pri‑F1、下游引物Pri‑R1、野生型探针和突变型探针；本发明采用的引物以及探针的终浓度及特异性都尤其适用于微滴式数字PCR检测中，采用的微滴式数字PCR技术进行检测，具有更高的灵敏度和特异性、准确性，通过本发明配制的反应液或试剂盒，可提高了检测灵敏度、提高检测的准确率，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导，对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒。

背景技术

BRAF基因定位在7号染色体上，编码B-raf蛋白，其参与丝蛋白激酶(MAPK)通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，BRAF基因发生突变后其所编码B-raf蛋白的氨基酸发生改变，造成BRAF激酶持续性激活，该持续性激活信号传导至下游信号通路导致细胞无限制增殖和分化，促使肿瘤细胞增长和进一步恶化。BRAF基因在多数癌症都存在不同比例的突变，其中在恶性黑色素瘤中突变发生率可高达70％，甲状腺乳头状癌、结直肠癌和浆液性卵巢癌等都有着不低的突变发生率，在其他如肺癌、胶质瘤、胃癌和肝癌等癌症中虽然突变发生率不高，但仍不能忽视对BRAF基因突变的筛选治疗。

目前，已鉴定在BRAF基因中存在多达30多种形式的突变，但绝大多数突变频率很低，其中最为显著的是以15号外显子上的V600E突变，所以对BRAF基因V600E位点进行检测可以得到更精确突变检出率，为结直肠癌治疗提供更有效的治疗建议。

目前常用的检测BRAF基因V600E位点的技术主要有FISH、ARMS-PCR检测、一代测序、NGS和IHC等，这些检测方法都存在操作复杂、对实验人员要求较高、检测灵敏度不足和检测周期长等缺点。例如一代测序以及NGS检测成本高，需要配备相应的人员进行分析；FISH、IHC需要经验丰富的实验人员，还存在人为操作误差。而微滴式数字PCR作为第三代PCR，能够不依赖标准曲线对样本进行准确的绝对定量，能够把整个反应分割成数万个微滴反应，避免抑制物的影响，更能挖掘出低频率突变DNA片段。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在公开一种生物技术领域，尤指一种人BRAF基因V600E位点突变检测的PCR反应液与试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的引物，根据人类15号外显子上的BRAF基因V600E位点的突变区域进行针对性设计的特异引物，其特征在于，所述引物为：

以SEQ ID NO.1所示序列为上游引物Pri-F1的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1：TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA

以SEQ ID NO.2所示序列为下游引物Pri-R1的核苷酸序列；

SEQ ID NO.2：GACAACTGTTCAAACTGATGGGAC。

本发明提供一种人BRAF基因V600E位点突变检测的探针，其特征在于，所述探针包括针对人BRAF基因V600E位点的野生型探针和突变型探针；

以SEQ ID NO.3所示序列为野生型探针Pro-WT-VIC的核苷酸序列；

SEQ ID NO.3：5’-VIC-CTAGCTACAGTGAAATC-MGB-NFQ-3’

以SEQ ID NO.4所示序列为突变型探针Pro-MUT-FAM的核苷酸序列；