[发明专利]一种培养CD90posi细胞的培养基及其培养方法

权利要求书

1.一种培养CD90posi细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、于无菌条件下，切取新鲜的肝癌组织，培养两代后，利用免疫磁珠间接标记分离法分离CD90 posi细胞，得CD90 posi细胞；

S2、用matrigel母液消化步骤S1所得CD90 posi细胞，然后重悬于培养CD90 posi细胞的培养基中，全程置于冰上处理，收集细胞悬液，得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液；所述培养CD90 posi细胞的培养基，包含如下组分及其重量百分数：DMEM/F-12基础培养基94~97.5%，细胞生长抑制剂0.5~3%，突变抑制剂2~3%；所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比6~8：2~4组成；所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比2~4：1~3组成；

S3、将步骤S2所得经matrigel母液消化后预冷的细胞悬液与matrigel溶液按体积比1~2：3~5混合均匀，置于34~37℃，放置35~45min，使其成胶，得胶状混合培养物；

S4、向步骤S3所得胶状混合培养物中加入步骤S2所述培养CD90posi细胞的培养基，置于36℃，3%的CO₂培养箱中孵育，24h换液一次，培养，即得。

2.如权利要求1所述培养CD90posi细胞的方法，其特征在于，步骤S1所述免疫磁珠间接标记分离法分离CD90 posi细胞的具体过程为：

（1）将冻存的肝癌组织从-80℃冰箱中取出，置于37℃的温度下复温，然后用PBS冲洗，于1600rpm的转速下离心5min，收集上清液，重复洗2遍，然后加入15mL的DMEM/F12+10%PBS培养液，轻轻吹打，重悬细胞使其分散均匀后转入100mL培养瓶中在37℃，5%的CO₂环境下培养，待细胞铺满瓶底80%进行传代培养，得原代培养细胞；

（2）用0.25%的胰蛋白酶消化步骤（1）所得原代培养细胞，倒置显微镜下观察到细胞脱离瓶底后用胶头吸管将贴壁细胞吹下，加入适量FBS终止消化后转入离心管中，加入PBS除去残余酶，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，用1mL的培养液重悬，充分混匀后，加入培养瓶中，继续加入5mL培养液，于37℃，5%的CO₂环境下培养，得传代培养细胞；

（3）用0.25%的胰蛋白酶消化步骤（2）所得传代培养细胞，充分吹打制备单细胞悬液，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，以10mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞，然后用针管吸取细胞悬液后快速推出以将粘聚成团的细胞分散，加入1mL的Anti-Human CD90 PE抗体，混匀后，于4℃，避光孵育30min，每10min取出摇匀一次，用磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与一抗Anti-Human CD90 PE结合的细胞，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，加入2mL的Anti-PE Microbed抗体，同样于4℃，避光孵育30min，磷酸盐缓冲液冲洗两次，除去未与二抗Anti-PE Microbed结合的细胞，加入1mL的磷酸盐缓冲液重悬细胞，将MS分选柱置入固定于分选器上的磁场中，先以1mL的磷酸盐缓冲液润柱，然后用移液枪将细胞悬液缓慢加入分选柱中，取离心管于磁柱下承接分选得到的CD90 posi细胞，待细胞悬液通过磁柱后，加入1mL磷酸盐缓冲液，冲洗磁珠，使细胞全部脱离磁柱，加入2mL磷酸盐缓冲液，并用配套的活塞快速将磁柱中结合的CD90 posi细胞充入离心管中，于1600rpm的转速下离心5min，去除上清液，即得。

3.如权利要求1所述的培养CD90posi细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述培养CD90posi细胞的培养基，由如下组分及其重量百分数组成：DMEM/F-12基础培养基96%，细胞生长抑制剂1.5%，突变抑制剂2.5%；所述细胞生长抑制剂由PD-1抑制剂与苦参碱按重量比7：3组成，所述突变抑制剂由松茸提取物和刺五加提取物按重量比3：2组成。

4.如权利要求1所述培养CD90posi细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述的matrigel母液的质量浓度为9~10mg/mL。

5.如权利要求1所述培养CD90posi细胞的方法，其特征在于，步骤S3所述的matrigel溶液的质量浓度为10~11mg/mL。