[发明专利]阿尔茨海默病大脑皮质类器官及其获得方法、应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及阿尔茨海默病大脑皮质类器官及其获得方法、应用，利用慢病毒感染，将APP与PS1突变基因转入小鼠诱导性多能干细胞，建立能够稳转APP与PS1突变基因的iPSCs系。随后通过3D培养，建立成熟稳定的小鼠阿尔茨海默病大脑皮质类器官培养体系，不但能够帮助研究者们进一步了解人体发育的机制，也可以用作疾病模型或者药物筛选平台。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及阿尔茨海默病大脑皮质类器官及其获得方法、应用。

背景技术

类器官培养(organoid culture)是最近几年随着干细胞领域的飞速发展，最新出现的一种人工组织培养技术。它主要是通过3D培养的方式，将干细胞从单个细胞生成的一种复杂的、类似活体组织的结构。在应用方面，涉及人造器官领域，以及研究活体组织发生、疾病形成的机理、药物实验以及组织替代疗法等方面。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是通过转入一些干细胞转录因子，将已经分化成熟的体细胞重编程得到的一类多能干细胞。它在生物学特性方面与胚胎干细胞类似，可以向多个方向的体细胞分化。与胚胎干细胞相比，iPS细胞取材方便，来源广泛，不具有免疫排斥反应及伦理道德等问题，是类器官培养最为理想的种子细胞。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种最常见的呈进行性发展的神经退行性疾病，淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)与早老蛋白(presenilin，PS)基因突变是导致家族性AD发生的主要因素。

长期以来AD转基因动物模型一直是探索AD病理生理机制的主要研究工具，然而AD转基因动物模型存在建模难度大，饲养周期长，体内多基因之间相互干扰等各种问题，使得研究某种关键病理事件的发生比较困难。目前，在国内的研究中，尚未见到大脑皮质类器官培养尤其是阿尔茨海默病大脑类器官培养相关的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明通过在iPSCs内过表达APPSwe/Ind(APP)及PSEN1(PS1)突变基因，获得稳转APP与PS1突变基因的iPSCs系，利用其培养AD大脑皮质类器官，建立一种能快速产生AD病理表型的实验模型。

本发明提供了一种阿尔茨海默病大脑皮质类器官的获得方法，包括以下步骤：

S1，通过慢病毒转染的方式，将APPSwe/Ind-PSEN1双突变基因转入小鼠iPSCs，得到含双突变基因的iPSCs；

S2，将含双突变基因的iPSCs传代培养，后利用差速贴壁法去除饲养层细胞，得到纯化的iPSCs；

S3，将纯化的iPSCs接种于细胞培养板a上在第一培养基中培养，每2天半量换液，培养4-6天后，将iPSCs形成的拟胚体转移到细胞培养板b上在第二培养基中培养，每两天换液一次，培养6-8天时，包被拟胚体周边伸出的半透明的神经上皮芽状突起，换用第三培养基低速摇动培养，每两天换液一次，持续培养60-65d后，收取标本，即得到阿尔茨海默病大脑皮质类器官；

所述第一培养基为：无LIF的iPSCs无血清培养基；

成分为：knockout DMEM(Gibco，10829018)；质量分数20％的KSR(Gibco，10828028)；100X×L-GlutaMax(Gibco，3505006)；100×NEAA(Gibco，11140-050)；1000X×2-ME(10mM)(2-Mercaptoethanol，Sigma，M3148)。

所述第二培养基为：神经上皮分化培养基；