[发明专利]一种DNA双链断裂修复工具及其应用

权利要求书

1.一种DNA双链断裂修复工具，其特征在于，利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。

2.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述干涉质粒为非同源序列。

3.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述微同源序列长0-12bp。

4.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，在干涉位置造成的基因组缺失为12-623bp大小。

5.如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述干涉质粒的具体构建过程，包括以下步骤：

步骤1：在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上的一个启动子和终止子中间插入mini-CRISPR序列，构建成针对不同基因组的干涉质粒pPmT；

步骤2：在基因组上选择靶基因中一个5’端为CC的32nt序列作为前间隔序列，并将所述前间隔序列的两条单链进行合成，通过退火，连接到pPmT上；

步骤3：将步骤2中构建的pPmT转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉，获取基因组缺失。

6.如权利要求5所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，步骤1中所述mini-CRISPR序列是由两个来自运动发酵单胞菌的重复序列和加在所述重复序列中间的间隔序列组成，所述间隔序列包含两个酶切位点。

7.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述酶切位点为BsaI。

8.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建含有两个或三个基因间隔序列的干涉质粒，同时干涉两个或三个基因，造成多基因失活。

9.如权利要求6所述的DNA双链断裂修复工具，其特征在于，所述mini-CRISPR序列还包括通过构建一段长片段两端基因的前间隔序列的干涉质粒，造成长片段缺失。

10.一种如权利要求1所述的DNA双链断裂修复工具在利用运动发酵单胞菌发酵生产乙醇中的应用。