[发明专利]一种DNA双链断裂修复工具及其应用

说明书

本发明公开了一种DNA双链断裂修复工具及其应用。通过利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。本发明提供一种内源的不需要外源修复系统和外源同源序列的DNA双链断裂修复工具，相比现有技术同源重组构建的DNA修复系统，具有构建方式简单并且构建周期短的特点，并且利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统就可实现基因组的单基因失活、多基因失活以及长片段缺失。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种DNA双链断裂修复工具及其应用。

背景技术

当今，随着能源的枯竭和环境污染日益严重，生物乙醇作为可再生资源受到广泛关注。目前，酿酒酵母菌和运动发酵单胞菌是发酵生产乙醇的主要菌株。相比于酿酒酵母菌，运动发酵单胞菌在发酵中具有温度耐受度更高、生产周期更短、原料利用率更高、不需要通气、代谢途径简单等优势；另外，运动发酵单胞菌还具有通过ED代谢途径进行糖酵解的特征。由此，运动发酵单胞菌在工业生产和基础研究领域都具有极高的研究价值。但是目前对运动发酵单胞菌的基因工程改良方面还在起步阶段，运动发酵单胞菌在发酵中底物利用范围窄、酒精耐受度低、酸耐受力低等问题，都亟需研究解决。

原核生物相比真核生物，绝大多数缺乏非同源末端连接的修复系统，且自身的同源重组效率非常低。目前，原核生物的DNA双链断裂修复主要依靠外源同源序列介导的同源重组和外源非同源修复系统介导的非同源末端连接，构建方式复杂且周期长。随着CRISPR系统越来越广泛的应用，传统的同源重组已经满足不了现在的基因编辑引起的DNA双链断裂修复的需求。而针对目前出现的问题，如何针对原核生物尤其是运动发酵单胞菌设计一种新型DNA修复工具，在基因水平上进行改良，以更好的适应生物乙醇发酵生产的需求成为亟需解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA双链断裂修复工具及其应用，通过在穿梭质粒插入一段mini-CRISPR序列构成高效便利的DNA双链断裂修复工具，相比现有技术同源重组构建的DNA修复系统，具有构建方式简单并且构建周期短的特点，并且利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统就可实现基因组的单基因失活、多基因失活以及长片段缺失。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种DNA双链断裂修复工具，利用运动发酵单胞菌的内源CRISPR系统构建干涉质粒，所述干涉质粒电击转化到运动发酵单胞菌中进行基因干涉，产生DNA双链断裂，所述修复工具选择DNA双链断裂两端的微同源序列进行修复，在干涉位置造成基因组缺失。

优选的是，所述干涉质粒为非同源序列。

优选的是，所述微同源序列长0-12bp。

优选的是，在干涉位置造成的基因组缺失为12-623bp大小。

优选的是，所述干涉质粒的具体构建过程，包括以下步骤：

步骤1：在大肠杆菌和运动发酵单胞菌的穿梭质粒pEZ15上的一个启动子和终止子中间插入mini-CRISPR序列，构建成针对不同基因组的干涉质粒pPmT；

步骤2：在基因组上选择靶基因中一个5’端为CC的32nt序列作为前间隔序列，并将所述前间隔序列的两条单链进行合成，通过退火，连接到pPmT上；

步骤3：将步骤2中构建的pPmT转化到运动发酵单胞菌中，进行基因干涉，获取基因组缺失。

优选的是，步骤1中所述mini-CRISPR序列是由两个来自运动发酵单胞菌的重复序列和加在所述重复序列中间的间隔序列组成，所述间隔序列包含两个酶切位点。

优选的是，所述酶切位点为BsaI。