[发明专利]用于检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒及其专用引物和探针

权利要求书

1.用于对SARS-COV-2冠状病毒进行实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物SA-F1和下游引物SA-R1，其中所述SA-F1的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述SA-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为选自FAM、ROX、CY5、HEX中的任一种，所述荧光淬灭基团为选自TAMRA、BHQ、Eclipse中的任一种。

4.用于对SARS-COV-2冠状病毒进行实时荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3中任一项所述的引物和探针；

使用所述试剂盒时的20μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和探针的用量为：每条引物的最终使用浓度各为0.1～1.0μM，探针的最终使用浓度为0.1～0.5μM。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为SARS-COV-2冠状病毒阳性质控品，阴性对照品为不含SARS-COV-2冠状病毒的反应体系。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在对SARS-COV-2冠状病毒进行非疾病诊断目的的检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

为一种用实时荧光定量PCR技术对SARS-COV-2冠状病毒进行非疾病诊断目的的定性和定量检测方法，包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将SARS-COV-2冠状病毒阳性质控品按照10倍梯度稀释至1×10⁷copies/μL、1×10⁶copies/μL、1×10⁵copies/μL、1×10⁴copies/μL、1×10³copies/μL、1×10²copies/μL、1×10¹copies/μL作为标准品；以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1-3中任一项所述的引物和探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；

2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1-3中任一项所述的引物和探针的引导下进行实时荧光定量PCR检测，同步进行检测阳性对照品和阴性对照品；

3)用得到的Ct值和荧光信号的变化实现对SARS-COV-2冠状病毒的定性检测，再根据Ct值和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含SARS-COV-2冠状病毒的拷贝数，实现定量检测。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤2)中的待测样品包括用于疫苗生产的原料、疫苗半成品及成品。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤1)和步骤2)中的20μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL、实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCRBuffer III 10μL、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL、5U/μL TaKaRa Ex Taq HS 0.4μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、探针0.8μL、RNase Free ddH₂O 5.6μL；

所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR检测条件为：反转录反应程序：42℃5min；95℃10sec；1个循环；PCR反应程序：95℃5sec；60℃20sec；40个循环。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤3)中的判定方法为：

若阳性对照品在荧光报告基团所对应的通道有S型扩增曲线，而阴性对照品在荧光报告基团所对应的通道无扩增曲线，则判断实验成立；否则实验结果无效；

当实验成立时进行以下判断：

若待测样品在荧光报告基团所对应的通道有S型扩增曲线，且Ct值≤38，则判定待测样品含有SARS-COV-2冠状病毒；

若待测样品在荧光报告基团所对应的通道有S型扩增曲线，且Ct值38，则判定待测样品为未确定样品，需重新提取RNA后进行检测；如果复检结果相同，则判定为弱阳性样品；

若待测样品在荧光报告基团所对应的通道无明显S型扩增曲线，则判定为阴性样品，即不含有SARS-COV-2冠状病毒。