[发明专利]PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基，所述培养基含有以下组分：1640培养基、胎牛血清、琼脂糖；各组分含量如下：1640培养基溶液10mg/mL，胎牛血清10‑20v/v％，琼脂糖0.3‑0.5wt％；其制备方法包括以下步骤：步骤一、配制4％琼脂糖溶液；步骤二、配制1％琼脂糖溶液；步骤三、所需细胞液体量计算；步骤四、配制3D培养基。本发明提供的PBMC体外3D琼脂糖水凝胶培养基配方简单、制备容易、成本可控，有利于大规模、标准化生产，可用于体外诊断目的的PBMC培养，可以充分模拟和反映PBMC在体内的生理活性，从而为进一步检测奠定基础。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种人外周血单个核细胞体外3D琼脂糖水凝胶培养基及其制备方法。

背景技术

体外细胞培养是指通过模拟机体内的生理条件，将从生物机体内取出的器官、组织或细胞等，在体外进行培养，并使其继续生存、生长和繁殖的过程。体外细胞培养已经成为现代生物研究的基本技术之一，广泛应用于现代生物医学和生物科学研究的各个方面。

目前，体外细胞水平的研究很大程度上是在二维培养条件下完成的。当细胞在二维条件下生长时，由于细胞与其基质之间复杂的细胞信号无法再现，细胞逐渐丧失了其体内原有的性状，在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远，因此体外实验数据无法完全转化为临床试验。近年来发展的3D(三维，three-dimensional)细胞培养技术则是应对这一挑战，作为一个更好的模型而更准确地体现体内生理条件，因此3D体外细胞培养方法获得的细胞在形态结构、增殖分化、基因表达及细胞的功能活动等方面均与二维培养存在显著不同。3D细胞培养能更好的模拟体内细胞生长的微环境，克服二维细胞培养方式的缺陷，为细胞水平的研究提供了一种更简单、更安全、更可靠的方法。

细胞在体外培养主要呈现悬浮型和贴壁型两种状态。其中贴附型细胞包括1、成纤维细胞型；2、上皮型细胞；3、游走细胞型；4、多型细胞型。悬浮型细胞见于少数特殊的细胞，如PBMC(外周血单个核细胞)、某些类型的癌细胞及白血病细胞。悬浮型细胞胞体呈圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。与之对应，细胞体外培养也分为两大类如下：

一、贴壁培养法：指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面才能生长，大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞均属于这一类。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。

二、悬浮培养法：指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。悬浮培养法是在微生物发酵的基础上发展起来的，主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如人外周血单个核细胞(PBMC)、杂交瘤细胞等。该法将采集到的活体动物组织分散、过滤、离心、纯化、漂洗后接种到适宜的培养液中，并置于特定条件下进行自由悬浮培养。便于进行定量研究。适于悬浮培养的动物细胞种类很少，大多数动物细胞属于贴壁依赖性的，因此不能悬浮培养。

琼脂糖凝胶是以琼脂糖为支持介质制备的凝胶，分为一般琼脂糖和经化学修饰后熔点降低的低熔点琼脂糖。琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。低熔点琼脂糖的熔点在62～65℃之间，融化后在37℃下可维持液态数小时，30℃时凝固成胶。标准熔点的琼脂糖凝胶可用于制备适于鉴定小片段DNA，RNA和≦1kb的PCR产物，主要用于分析电泳，以提高跑胶和印迹的速度。低熔点琼脂糖所制凝胶具有更高的筛过特性，更透明，是理想的DNA和RNA电泳产品，也适合组织培养细胞的克隆和病毒空斑分析。

发明内容