[发明专利]一种重组脂肪酶突变体、基因、载体及其应用

权利要求书

1.一种重组脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：（1）第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，且第195位缬氨酸突变为亮氨酸；（2）第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，第195位缬氨酸突变为亮氨酸，且第145位亮氨酸突变为缬氨酸；（3）第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，第195位缬氨酸突变为亮氨酸，且第145位亮氨酸突变为天冬酰胺；（4）194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，且第195位缬氨酸突变为亮氨酸，且第154位的亮氨酸突变为甘氨酸；（5）194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，且第195位缬氨酸突变为亮氨酸，且第156位的丝氨酸突变为组氨酸；（6）第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，第195位缬氨酸突变为亮氨酸，第145位亮氨酸突变为缬氨酸，且第154位的亮氨酸突变为甘氨酸；（7）第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，第195位缬氨酸突变为亮氨酸，第145位亮氨酸突变为天冬酰胺，且第154位的亮氨酸突变为甘氨酸。

2.如权利要求1所述重组脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第194位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，第195位缬氨酸突变为亮氨酸，第145位亮氨酸突变为缬氨酸，且第154位的亮氨酸突变为甘氨酸。

3.一种权利要求1所述重组脂肪酶突变体编码基因。

4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述重组脂肪酶突变体在制备 (2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：将整合有重组脂肪酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以发酵上清或分离纯化后的酶作为催化剂，以外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯为底物，以pH值为3.0-10.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，在25-50 ˚C、600rpm条件下转化反应，反应结束后，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的反应液，将反应液分离纯化，获得(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述转化体系中，催化剂用量以纯酶重量计为0.1-0.5 g/L，所述底物的初始浓度为1.0-2.0mol/L。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：

将整合有重组脂肪酶突变体基因的工程菌接种至BMGY培养基，在30˚C培养12 h后，离心，转接至含体积浓度0.5%甲醇的BMMY培养基，在30˚C下诱导培养72 h，离心，取上清液经超滤膜超滤浓缩后，获得浓缩酶液；将浓缩酶液与经结合缓冲液平衡过的Ni²⁺亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，以透析缓冲液透析24 h，取截留液-80℃冻干，获得重组脂肪酶突变体纯酶；所述结合缓冲液为含300 mM NaCl 的50 mM、pH 8.0磷酸钠缓冲液；所述冲洗缓冲液为含300 mM NaCl和15mM咪唑的50 mM、pH 8.0磷酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液为含300 mM NaCl和500 mM咪唑的50 mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液；所述透析缓冲液 20 mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液。