[发明专利]一种重组脂肪酶突变体、基因、载体及其应用

说明书

本发明公开了一种重组脂肪酶突变体、基因、载体、工程菌及其制备(2S,3R)‑N‑乙酰‑哌啶‑2,3‑二甲酸二甲酯的应用，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第145位、154位、194位、195位进行单突变或者组合突变获得的。该突变体相比于野生型酶在转化上述反应时催化活力和底物耐受性大大提高，反应进程耗时明显缩短。相比于化学法制备(S,S)‑2,8‑二氮杂双环[4,3,0]壬烷，本发明提供的技术所得产品立体选择性高，反应条件更加温和，对环境友好，且对设备要求降低，大大减少了生产成本。

(一)技术领域

本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及来源于SporisoriumreilianumSRZ2的脂肪酶SRL突变体、突变体基因、含有该突变体基因的重组载体、含有该突变体基因的重组基因工程菌以及脂肪酶SRL突变体在制备(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯中的应用。

(二)背景技术

脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)又称三酰基甘油酰基水解酶(Triacylglycerolacylhydrolase)，是一类能够水解长链脂肪酸甘油酯生产游离脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的水解酶，在自然界中普遍存在。根据反应介质以及反应物的不同，脂肪酶还能催化各种类型的反应，例如催化各种脂肪酸与醇合成酯，酯交换，醇解、氨解以及其它一些特殊的化学反应。其中，微生物脂肪酶具有种类多、活性高、稳定性较好，选择性和底物特异性优良，反应pH和温度范围广泛等特性，在工业生产中有着重要应用。真菌来源脂肪酶Candidarugose lipase(CRL)、Rhizomucormiehei lipase(RML)、Rhizopus oryzae lipase(ROL)、Candida antarctica lipase B(CALB)和细菌来源脂肪酶Burkholderiacepacia lipase(BCL)等都已经实现商品化生产。

(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷是合成第四代喹诺酮类抗菌药物莫西沙星的重要手性中间体，后者是由德国拜耳公司研制，主要用于治疗急性窦腺炎、慢性支气管炎等呼吸道疾病的广谱抗生素。对于(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷的制备，传统的合成方法主要有化学拆分法、不对称合成法和手性源法。化学拆分法是目前主要的应用方法，具体是以2,3-二甲酸吡啶为起始原料，经脱水、氨解、环合、还原、化学拆分等步骤获得目的产物。但是该方法存在着拆分步骤产物光学纯度低、收率低、能耗大、污染严重等问题，已不符合当代绿色化学的发展趋势(EP 0550903 A1，US 20080221329 A1)。近年来，利用生物酶法代替化学法改善反应条件，降低生产成本，提高产物选择性已成为关注的焦点。生物拆分法不仅具有高度的化学、区域和立体选择性，并且反应条件温和、对环境友好，有效弥补了化学法的不足。利用脂肪酶为催化剂，可高效拆分外消旋的N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯获得光学纯的(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯，进而用于合成(S,S)-2,8-二氮杂双环[4,3,0]壬烷。相比于化学拆分法，脂肪酶拆分法将拆分步骤提前，原子经济性强，立体选择高，产物光学纯度高，并且避免了化学拆分剂的使用。目前关于脂肪酶法拆分生产(2S,3R)-N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯的报道较少，专利US 8680276 B2报道了采用40g/L的固定化南极假丝酵母脂肪酶B在140h内将80g/L的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全。Nitin W.Fadnavis等人用40g/L的液态南极假丝酵母脂肪酶B(CALB(5000TBU))取代固定化南极假丝酵母脂肪酶B，在16h内将80g/L的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全(Organic Process ResearchDevelopment卷:19期:1页:296-301)。近期Shen等人采用0.1g/L的南极假丝酵母脂肪酶B突变体在5h内将243.26g/L的外消旋N-乙酰-哌啶-2,3-二甲酸二甲酯拆分完全，大大的提高了底物浓度，减少了反应时间，但是南极假丝酵母脂肪酶B突变体存在温度稳定性较差、高底物浓度下易失活的问题，不利于工业化生产应用(CatalysisScienceTechnology卷：8期：18页：4718-4725)。