[发明专利]基于通用探针芯片的多重定量PCR检测系统

说明书

本发明提供了基于通用探针芯片的多重定量PCR检测系统。具体地，本发明的基于表面探针的定量PCR检测体系包括：(a)一固相载体；(b)待检测序列特异性引物对，包括第一引物和第二引物；(c)淬灭探针。本发明还提供了相应的检测方法、检测装置和应用。本发明可快速、简便、高效、同时对多种靶序列进行定量检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地涉及基于通用探针芯片的多重定量PCR检测系统。

背景技术

在常规的Taqman荧光定量PCR(Taqman qPCR)中，在检测体系中存在用于扩增的引物对以及用于检测的Taqman探针。其中，在溶液里的Taqman探针一侧(或一端)有荧光基团(fluorophore)，另一侧(或另一端)有淬灭基团(quencher)。该探针完好的时候，因为淬灭剂和荧光剂距离足够近，淬灭剂就能有效抑制荧光剂，从而没有(或基本没有)荧光信号。当溶液里存在与该探针序列匹配的核酸样本时，那么在样本被PCR扩增的过程中，该探针被扩增酶剪切，于是荧光剂和淬灭剂会互相脱离开来，导致抑制作用减少或消失，从而使得荧光剂产生荧光信号。

扩增方面在多重扩增的情况下，不同的探针和引物容易引起干扰。特别是重数比较高的情况下，一个有效的办法是使用巢式PCR。但是巢式PCR一般需要两步法来做，中间需要添加引物和酶，同时稀释非特异性产物。

对于多重qPCR而言，因为每一个待测序列需要一种发光光谱可与其它荧光剂区别开来的荧光剂，所以同一个qPCR反应中能同时进行检测的不同种核酸数量受到很大的限制，通常一个qPCR反应只能做到4-5重多重检测。此外，即使能够实现多重qPCR，因为需要同时读取多个不同荧光剂，因此其对应的光学检测设备设计复杂，造价非常昂贵。优化需要大量实验，探针合成也比较昂贵。

因此，本领域迫切需要开发一种通用型的基于微阵列的多重PCR引物设计和扩增体系，以达到经济地定量检测多重特定序列的目的。

发明内容

本发明的目的就是提供一种通用型的基于微阵列的多重PCR引物设计和扩增体系，以达到经济地定量检测多重特定序列的目的。

在本发明的第一方面，提供了一种基于表面探针的定量PCR检测体系，所述检测体系包括：

(a)一固相载体，所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区，其中，n为≥2的正整数，并且至少一个子检测区为表面定量子检测区；

其中，所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有微阵列表面探针，所述微阵列表面探针为单链核酸，并且所述微阵列表面探针的一端固定于所述的固相载体的表面，并且所述微阵列表面探针带有第一可检测标记物，所述的第一可检测标记物选自下组：荧光基团、发光基团、发光标记物、量子点、或其组合；

(b)待检测序列特异性引物对，包括第一引物和第二引物；

(c)淬灭探针，所述淬灭探针的一侧或一端或中间连接有淬灭基团；

并且，所述淬灭探针与至少一个表面定量子检测区的微阵列表面探针可结合从而形成双链结构，并且在所述双链结构中，所述的淬灭探针的淬灭基团使得所述的微阵列表面探针的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被全部或部分淬灭；当检测体系中的所述淬灭探针的浓度降低时，至少一个表面定量子检测区的微阵列表面探针的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号的淬灭程度降低。

在另一优选例中，所述第一引物为正向特异引物。

在另一优选例中，所述第二引物为反向特异引物。

在另一优选例中，所述检测体系还包括：(d)通用引物对，包括正向通用引物和反向通用引物(即第四引物和第五引物)。