[发明专利]一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用

说明书

本发明提供了一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；所述慢病毒载体包括pLenti‑CMV‑GFP‑EF1a‑Puro。本发明基于人源G3BP1基因和载体pLenti‑CMV‑GFP‑EF1a‑Puro，扩增了人源G3BP1基因DNA序列，成功构建pLenti‑GFP‑G3BP1重组慢病毒载体，并利用慢病毒包装系统成功构建稳定表达GFP‑G3BP1蛋白的HeLa细胞系，在探究应激刺激调控SG形成机制方面具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，尤其涉及一种G3BP1重组慢病毒载体、由此构建的稳定表达GFP-G3BP1的细胞系及其在实时监测应激颗粒形成中的应用。

背景技术

细胞受到病毒感染、砷酸盐刺激、热休克或氧化应激时，细胞内会形成致密的颗粒状结构，称为应激颗粒(stress granules，SG)。研究表明：外源刺激可以抑制细胞启动蛋白质翻译，导致mRNAs从核糖体中释放，非翻译mRNAs和RNA结合蛋白聚集形成SG。应激状态下，抑制细胞内SG的形成会促进细胞死亡，表明SG的形成有助于细胞应对外界刺激。SG中含有大量的翻译起始成分，包括40S核糖体亚基、poly(A)结合蛋白和翻译起始因子等，但不包含大核糖体亚基，因为翻译终止发生在大核糖体亚基进入翻译复合体之前。形成SG的主要标志蛋白包括：RNA结合蛋白(RBPs)、胞内蛋白TIA-1、TIA-1相关蛋白1(TIAR)和Ras-GTPase活化蛋白SH3结构域结合蛋白(Ras-Gap-SH3 domain-binding protein，G3BP)，这些蛋白主要通过分子内和分子间相互作用聚集形成SG。

G3BP包括G3BP1和G3BP2两个亚型，均含有以下结构域：NTF2样结构域、RNA识别基序(RRM)、酸性区域以及C端精氨酸富集区(RGG)，其中C端的RRM和RGG具有DNA/RNA解旋酶活性并参与识别RNA。G3BP1蛋白是高度保守的多结构域蛋白，近年来研究表明G3BP1对活化环鸟苷酸-腺苷酸合酶(cGAS)和识别DNA非常重要，它通过促进cGAS复合物的形成来促进cGAS与DNA的结合。G3BP1的缺失使得cGAS不能有效结合DNA，从而抑制cGAS介导的IFN形成。此外，G3BP1还是RIG-I信号通路中的重要组分，G3BP1有助于RIG-I诱导抗病毒细胞因子IFN-β的产生。这些报道说明G3BP1在抗病毒先天性免疫中发挥重要作用。

SG是宿主应对外界应激的方式，因此对于多数病毒而言，SG能够抑制病毒复制，而许多病毒通过改变细胞内SG的成分或抑制细胞内SG的形成来逃逸SG的抗病毒作用。病毒与SG的互作机制大致分为以下三类：1)病毒对PKR-eIF2α通路的调控：汉坦病毒感染宿主后，可以抑制依赖PKR活化的SG形成，这可能是该病毒能够持续感染的关键；2)病毒“挟持”SG核心蛋白：塞姆里斯森林病毒(SFV)在感染早期，使eIF2α磷酸化从而诱导SG的形成，在感染后期，G3BP1蛋白被SFV的非结构蛋白P3(nsP3)包裹在病毒复制复合物中，抑制SG的形成；3)病毒切割SG的组分：脊髓灰质炎病毒利用自身编码的3C蛋白酶切割SG成核蛋白G3BP1，从而抑制SG的形成。以上研究结果说明病毒通过多种方式调控SG的形成，逃逸SG的抗病毒作用。

不同于其他病毒，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是目前已知的唯一能够稳定诱导SG形成、并且在细胞中高效复制的病毒，但是机制尚不清楚。

CN109897827A公开了用于研究应激颗粒的斑马鱼模型的构建方法及其用途，建立了一种用于实时观测SG形成及变化的可视化在体模型，所述模型是在所述细胞的基因组中的内源性的应激颗粒相关基因(如G3BP1基因)内或编码区两端且读框不变地插入荧光基因的斑马鱼模型。但是该模型构建方法繁琐、成功率低、成本较高，实用性差。

因此，有必要提供新的技术手段研究NDV诱导SG的机制，为进一步探索病毒感染调控SG机制奠定基础。

发明内容