[发明专利]一种甘精胰岛素晶体的制备方法

说明书

本发明涉及胰岛素结晶技术领域，具体涉及一种甘精胰岛素晶体的制备方法。该制备甘精胰岛素晶体的方法采用气相扩散悬滴法，包括如下步骤：(1)配制含有如下成分的结晶液：Tris 0.2～1.0M，柠檬酸0.2～1.0M；所述结晶液的pH为8.0～11.0；(2)将甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合，得到混合结晶溶液；(3)将所述混合结晶溶液悬滴于盛有所述结晶液的母液池上方，静置培养。利用该方法能够得到形状规则，单晶形式的大小合适的甘精胰岛素晶体，X‑射线衍射分辨率高，可正确解析甘精胰岛素的晶体结构。

技术领域

本发明涉及胰岛素结晶技术领域，具体涉及一种甘精胰岛素晶体的制备方法。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。于1921年由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特首先发现。1922年开始用于临床，使过去不治的糖尿病患者得到挽救。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长，胰岛素的需求越来越多，单纯的从动物细胞提取已满足不了病人的需求，胰岛素及胰岛素类似物的生产迫在眉睫。其中一种新开发的长效胰岛素类似物-甘精胰岛素，正在越来越多被医生和患者所接受和使用。

甘精胰岛素(recombinant glycine-arginine insulin)是一种通过基因重组技术获得并用于治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病的长效胰岛素类生物制品，其持续控制血糖的原理为：皮下注射后甘精胰岛素分子立即聚合，因而溶解度降低，形成甘精胰岛素沉淀物，机体吸收延迟，其降糖作用的时间也被延长。甘精胰岛素是当前治疗Ⅰ、Ⅱ型糖尿病十分方便和有效的药物。国外由Aventis公司生产的甘精胰岛素注射液(商品名Lantus)与人胰岛素的不同之处在于其A链羧基端21位的天门冬氨酸被甘氨酸所取代，B链羧基端30位苏氨酸后的31和32位连接了两个精氨酸，改造后的活性胰岛素即甘精胰岛素，由E.coli表达生产。可在糖尿病患者体内平稳发挥药效24小时以上，并且无明显的血药高峰值和低峰值，很适合用于低基础胰岛素的替代治疗。

甘精胰岛素是一种在中性液中溶解度低的人胰岛素类似物。在本品酸性(pH＝4)注射液中，完全溶解。其主要作用是调节糖代谢。中国糖尿病防治指南认可：甘精胰岛素是唯一平稳无峰、作用时间长达24小时的胰岛素。符合人类生活作息周期，每天只需注射一次，而被患者和医生所青睐。

目前，现有技术中对甘精胰岛素结晶方法的报道均是用于甘精胰岛素工艺生产的结晶方法，得到的产品多为混晶形式，纯度低，干扰杂质较多，无法用于晶体结构的解析。因此，需要一种能够制备单晶形式的甘精胰岛素晶体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘精胰岛素晶体的制备方法和结构解析方法，以得到单晶形式的甘精胰岛素晶体，提高其纯度。

本发明第一方面提供一种制备甘精胰岛素晶体的方法，采用气相扩散悬滴法，包括如下步骤：

(1)配制含有如下成分的结晶液：Tris 0.2～1.0M，柠檬酸0.2～1.0M；所述结晶液的pH为8.0～11.0；

(2)将甘精胰岛素溶液与所述结晶液混合，得到混合结晶溶液；

(3)将所述混合结晶溶液悬滴于盛有所述结晶液的母液池上方，静置培养。

作为一种优选的实施方案，所述结晶液的pH为9.0～10.5。

作为一种优选的实施方案，所述结晶液中含有如下成分：Tris0.4～0.8M，柠檬酸0.4～0.8M。

作为一种优选的实施方案，所述结晶液中还含有乙酸铵。

作为一种更优选的实施方案，所述结晶液中乙酸铵的浓度为10.0～100mM，优选为15～35mM。发明人意外地发现，乙酸铵的浓度在此范围，甘精胰岛素的结晶效果较好。