[发明专利]一种BSA单抗制备方法

权利要求书

1.一种BSA单抗制备方法，其特征在于，所述BSA单抗制备方法为：

S1：制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽，其中多肽的肽序为KEACFAVEGPKLVVSTQT，取其中5mg多肽与KLH偶联；

S2：动物免疫：选取五只小白鼠，首先进行初次免疫，将KLH偶联多肽与等体积福氏完全佐剂混合，等到乳化后对小白鼠进行皮下免疫，为每只小白鼠皮下注射400ul乳化液；接着进行第二次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，并重复第二次免疫步骤对小白鼠进行第三次免疫，进行第三次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第三次免疫后小白鼠的血清保存；接着进行第四次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，第四次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第四次免疫后小白鼠的血清保存；

S3：细胞融合：复苏和培养小白鼠骨髓瘤细胞，取四次免疫后终免的小白鼠脾脏并用培养基制备成单个细胞悬液，按1：5的比例混合小白鼠的骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，加入PEG进行细胞融合，制成融合细胞液，将100ul/孔的2×HAT完全培养基铺入96孔板中，在每个孔内加入100ul融合细胞液，在融合细胞培养过程中用1×HAT进行半量换液；

S4：筛选：用Balb/c健康小鼠制备饲养细胞，有限稀释选好的融合孔细胞，用1×HAT培养液稀释细胞，将细胞悬液分别加入含饲养细胞的96孔中，浓度分别为100ul/孔，孔中分别含有0.75、1.5和3个饲养细胞，并加入含有质量分数为5％的CO₂，在37℃的温度下对饲养细胞进行培养；10天后在显微镜下观察饲养细胞克隆生长情况，用ELISA检测细胞克隆孔，选择阳性值高且单克隆的孔，且筛选出来的抗体能够与BSA结合，不能够与HAS结合；

S5：细胞扩增：培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞；

S6：抗体生产纯化：将小白鼠用石蜡致敏后，向小白鼠的腹腔内注射杂交瘤细胞；观察7-10天后小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水；进行预处理后的腹水使用Protein G柱子进行孵育，洗脱，最终得到纯化的单克隆抗体；

S7：单克隆杂交瘤细胞样本检验：首先利用Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，再使用SMART Race技术将样品RNA反转录成cDNA；利用FastPfu Fly DNAPolymerase试剂盒扩增并获得重链和轻链可变区；使用T4连接酶将目标片段连接至pUC57载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，后挑取单克隆进行测序，最后使用IMGT/V-QUEST数据库进行测序结果比对做进一步分析，并得到检验结果。

2.根据权利要求1所述的一种BSA单抗制备方法，其特征在于，所述ELISA检测步骤为：

(1)抗原包被量为100ng/孔，其中抗原为HAS、BSA标准品，每孔浓度为100ul，利用PBS进行稀释，在4℃温度下保存17-19h；

(2)倒掉上清液，每孔加入200ul的无蛋白封闭剂，在37℃温度下，震荡2h；

(3)倒掉上清液，拍干液体，在-20℃温度下冻存备用；

(4)冻存后取出包被好的板子放至室温，每孔加入100ul的血清稀释液，在37℃温度下放置1h。

(5)用0.1％的PBST洗板3次；

(6)用辣根酶标记山羊抗小鼠，并用浓度为1ul、体积10ml的PBS稀释，在37℃温度下放置45min；

(7)用PBST洗板3次；

(8)在每个孔中加入100ul的TMB，在37℃温度下放置15min；

(9)加入2M盐酸终止液终止反应，并利用450nm波长测OD值。

3.根据权利要求1所述的一种BSA单抗制备方法，其特征在于，所述ELISA检测细胞克隆孔过程中，若检测不确定是单克隆，则需要进行第二次有限稀释。