[发明专利]一种BSA单抗制备方法

说明书

本发明提供一种BSA单抗制备方法，所述制备方法为：制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽，并取其中5mg多肽与KLH偶联；动物免疫：选取五只小白鼠，首先进行初次免疫，接着进行第二次免疫，并重复第二次免疫步骤对小白鼠进行第三次免疫，接着进行第四次免疫；细胞融合；筛选：选择阳性值高且单克隆的孔；培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞；得到纯化的单克隆抗体。本发明能够制备出大量的单克隆抗体，将制备的抗体分装后在‑20℃温度下保存，短期内使用在2‑8℃存放，使用时，仅需按所需浓度将此溶液进行稀释，现配现用，大大提高了抗体的生产量，并通过检验发现单克隆抗体抗体能够与BSA结合，不能够与HAS结合，为未来医学发展奠定了基础。

技术领域

本发明属于单抗制备方法领域，尤其涉及一种BSA单抗制备方法。

背景技术

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

单抗制备的过程主要是：1.免疫动物：免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程，一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

2.细胞融合：采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平器皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

3.选择性培养：选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡，未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

5.单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。

(1)体内诱生法：取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。

(2)体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种BSA单抗制备方法，所述BSA单抗制备方法为：

S1：制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽，其中多肽的肽序为KEACFAVEGPKLVVSTQT，取其中5mg多肽与KLH偶联；